褪黑素对高糖条件下培养的大鼠系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

《褪黑素对高糖条件下培养的大鼠系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、独创性声明　本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。　　学位论文作者签名：　日期：　　　　年　　　　月　　　　日　　学位论文版权使用授权书　本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学

2、可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。　　保密□　，在＿＿＿＿＿年解密后适用本授权书。　本论文属于　不保密□。　（请在以上方框内打“√”　）　　学位论文作者签名：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　指导教师签名：　　日期：年月日日期：年月日1　　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文　褪黑素对高糖条件下培养的大鼠系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响前言糖尿病肾病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病(DM)全身性微血管并发症，

3、亦是导致慢性肾衰的主要原因之一。如何有效防治DN已是当前肾脏病学者们面临的一个重要问题。有外国学者发现在糖尿病肾病晚期肾脏细胞凋亡往往与肾功能恶化程度成正比[1]，抑制凋亡则可延缓肾小球硬化。褪黑素是松果体分泌的神经内分泌激素，体内众多器官系统均受到影响和调节，肾脏亦是其靶器官之一。近年研究显示，褪黑素对糖尿病肾病有明显的保护作用[2,3,4]，但褪黑素对糖尿病肾病晚期MC凋亡的影响尚未检索到有关报道。本试验选用大鼠MC为对象，来观察褪黑素对高糖诱导的MC凋亡的影响。材料和方法一.材料及试剂大鼠MC株（HBZY-1）由中国典型动物保成中心提供

4、；褪黑素购自美国Sigma公司；新西兰进口小牛血清(FCS)及DMEM低糖培养基均为美国Hyclone公司产品；Annexin-Ⅴ/PI（美国BD公司）；兔抗大鼠细胞色素C单克隆抗体、兔抗大鼠caspase-3单克隆抗体、兔抗大鼠Bax单克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、噻唑蓝（MTT）、台盼蓝染料、碘化丙啶（PI）、PBS缓冲液、胰蛋白酶、sp通用试剂盒、DAB显色液、二甲基亚砜(DMSO)、Taq酶、RNAPCRkit试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；各种引物合成(武汉中和)；Facscaliblr流式细胞仪（美国BD公司）

5、、Cellquste分析软件；HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统；PCR仪(Gene-AmpPCRSystem9700，美国)；CO2孵箱(Heraeus,美国)；SUNRISE全自动酶标仪。将褪黑素12mg1　　华　中　科　技　大　学　硕　士　学　位　论　文　溶于0.5ml无水乙醇中，后加4.5ml无菌水至5ml，配成10-3mmol/L母液，用时稀释为工作液，4℃冰箱保存。二.方法肾小球系膜细胞的培养：将大鼠系膜细胞接种于50cm2无菌玻璃培养瓶内，加入含10%灭活FCS的DMEM(低糖)培养液，在37℃、5%CO2的孵箱内

6、培养。常规换液、分离和传代。本实验采用5～11代大鼠肾小球系膜细胞。2.MTT法检测系膜细胞增殖：将85%-95%融合的系膜细胞用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，加10%FCSDMEM培养液，调细胞密度为1×106/ml。接种于96孔平底培养板上，每孔100ul。待细胞长满单层后。加入含不同浓度褪黑素（10-5、10-7、10-9mmol/L），对照组仅以1%FCS刺激，调整每孔到100ul，同时调节各组培养液糖浓度为30mmol/L，作用72h（每组设6个复孔）。经台盼蓝染色活细胞达95%以上，分别于培养结束前4h加入MTT20ul/孔

7、(5g/L)。每孔弃去上清，然后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150ul，于37℃空气浴振荡10min，置酶标仪测量波长为570nm处读取吸光度A(光密度OD)值。3.高糖诱导系膜细胞：凋亡实验前将细胞爬片所用的0.5×0.5cm盖玻片先经酸处理后洗涤干净、高压灭菌后用无菌的镊子放置到12孔培养板中，为防脱片使用多聚赖氨酸预处理玻片。向每一个培养板孔中加入多聚赖氨酸，以覆盖全部板底为量。放置4h后吸净培养板中的多聚赖氨酸，三蒸水清洗（注意无菌操作），37℃恒温箱中烘干备用。取对数生长期系膜细胞以1×106或5×106每孔接种于12孔培养板中，

8、待细胞贴壁后生长至70%融合时，用含1%小牛血清DMEM低糖培养液37℃孵育24h，使细胞生长同步进入休止期。分五组：低糖对照组，糖浓度为5.5mmol/L；高糖对