肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和

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1、肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和【摘要】观察肾康丸对体外高糖培养的大鼠系膜细胞(MC)增殖、细胞外基质分泌(ECM)和细胞周期的影响。【方法】将16只C分为5组:高糖模型组(30mmol/LGlu),正常血清组(体积分数5%正常血清),开博通组(5%开博通血清)及肾康丸高、低剂量组(5%肾康丸高、低剂量血清),另设低糖(10mmol/LGlu)模型组。培养72h后,采用四甲基偶氮噬盐(MTT)法测定各组细胞增殖,双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测上清纤维连接蛋白(FN)含量,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】高糖培养的MC显

2、著性增殖,上清FN含量显著性增加,并出现细胞周期异常,肾康丸能抑制MC增殖,减少FN分泌,并使Go/G期细胞比例显著性增加,而与期及G2/M期细胞比例减少。【结论】肾康丸可通过调整MC细胞周期异常,进而抑制高糖诱导的MC增殖和ECM分泌。【关键词】肾康丸药理学糖尿病肾病中药疗法细胞周期胞培养大鼠糖尿病肾病(diabetiephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)全身性微血管并发症之一,也是导致DM患者死亡的重要原因。约40%的Ⅰ型DM和5%~10%的Ⅱ型DM患者可以发生DN。DM可由多种途径损害肾脏,并累及肾

3、脏的所有结构,从肾小球、肾血管直到肾小管和肾间质,随着病情的进一步发展,可影响肾功能不可逆转,最终导致终末期肾功能衰竭[1]。迄今为止,西医除强调控制血糖、血压外,对该病尚无特效药物。中药制剂肾康丸在临床用于治疗DN多年,具有确切的保护DM患者肾脏的作用[2-3]。肾小球系膜细胞(Mesangialcell,MC)的变化在肾脏疾病的发病中具有重要的作用[4]。为进一步探讨肾康丸治疗DN的作用机制,我们观察了肾康丸对体外高糖培养的MC增殖、纤维连接蛋白(Fibroin,FN)分泌和细胞周期的影响,并与血管紧张素转换酶(Angiotensincon

4、vertingenzyme,ACE)抑制剂开博通作对照。现报道如下:1材料与方法1.1动物和细胞株C细胞株,购于武汉大学。1.2受试药品和主要试剂肾康丸由黄芪、芡实、金樱子、玉米须、水蛭等组成,南方医科大学珠江医院药剂科生产,批号:20031214;开博通片由上海中美施贵宝药业有限公司生产,批号:0402032。RPMI1640干粉为美国GIBCO公司产品;小牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚枫(DMSO)、碘化丙啶(PI)染液、L谷氨酰胺和HEPES均为美国Sigma公司产品;丙酮酸钠为AMRESCO

5、公司产品;RNA酶(Rnase)为上海生工产品;FN双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒由美国Diagnositca公司提供。1.3主要仪器CO2培养箱由广东新绿洲生物技术研究所生产;XD101型倒置显微镜由南京江南光电股份有限公司提供;Sodel∑960型酶标仪为MeterechInc公司产品;FACS20流式细胞仪为美国Bectondiskson公司产品。1.4药物血清制备16只大鼠随机分为4组:正常血清组,开博通组,肾康丸高、低剂量组。开博通组,肾康丸高、低组分别按5mg/kg、2.4g/kg和1.2g/kg(按照人与大鼠体表面积换算

6、,分别相当于成人37.5mg/d、24g/d、12g/d,即相当于成人临床用量的1倍、2倍和1倍)灌服相应药物混悬液,连续7d。正常血清组灌服等体积生理盐水。最后1次灌药(灌药前禁食不禁水12h)1h后,30g/L戊巴比妥(1.5mL/kg)腹腔麻醉,腹主动脉采血,3000r/min,离心10min,分离血清,56℃,30min水浴灭活,0.22μm微孔滤膜过滤,分装,-20℃保存。广州中医药大学学报2007年第24卷第6期肖炜,等.肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响1.5MC的培养与分组MC加入含体积分数10%胎牛

7、血清(FCS)的RPMI1640培养液(含200μg/mL青、链霉素及2.38g/LHEPES),置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,取4~8代MC进行实验。每次实验前细胞经消化,1000r/min离心5min,DHanks液洗涤,然后重悬细胞(1×105/mL)并用含体积分数1%FCS的RPMI1640培养液培养24h,以使所有细胞同步化。同步化后,将MC分为5组:高糖模型组(体积分数1%FCS、30mmol/LGluRPMI1640培养液),正常血清组(体积分数5%正常大鼠血清、体积分数1%FCS、30mmol/LGluRP

8、MI1640培养液),开博通组(体积分数5%开搏通药物血清、体积分数1%FCS、30mmol/LGluRPMI1640培养液)及肾康丸高、低剂量组

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