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1、肾康注射液对肾小球系膜细胞增殖及自分泌FN的效应论文李锋，王汉民，行利，王长海，程庆砾，叶传蕙【关键词】肾康注射液【Abstract】AIM:ToexplorethemechanismofShenKangInjection(SKI)onprohibitingglomerulosclerosis(GS)soastoprovidefreshevidenceforclinicalapplicationofSKIintreatingchronicrenalfailure(CRF).METHODS:Usingse
2、rumpharmacologicaltestofChineseherbs,theeffectsofSKIontheproliferationinculturedhumanglomerularmesangialcells(GMC)andtheleveloffibronectin(FN)secretioninculturedGMCanner(P0.01,P0.05).C）的增殖及自分泌IL1有明显抑制作用.但SKI含药血清对GMC增殖及其自分泌纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)水平影响如何未见报道
3、.我们的实验初步揭示SKI及其含药血清对GMC的效应异同，为该制剂临床应用提供初步依据.1材料和方法1.1材料SKI：20mL/支(含生药量6g，批号：970718），成都中医药大学附属医院肾病研究室提供；肝素钠注射液：购于解放军总医院药剂科；雄性C培养和FN检测试剂及器械由解放军总医院肾内科实验室提供.1.2方法新鲜肾组织用无菌4℃生理盐水冲洗，剪肾皮质成碎块，入上层筛网（孔径250nm），针芯轻压并冲洗肾组织入中层网(106nm)、继续轻研并冲洗组织碎屑入下层网(75nm)，收集此层组织悬液镜下观察
4、为纯净肾小球（98%）、即停止冲洗，移入离心管离心（800rmin-1）3min，弃上清，加入100gL-1V型胶原酶2~3mL混匀、置37℃孵育箱消化15~20min，至肾小球包曼囊剥离、细胞散出，用100gL-1FCS+RPMI1640终止消化，离心（800rmin-1）2~5min，弃上清，将沉淀混匀加GMC培养液，入37℃，50mLL-1CO2孵育箱中培养.GMC鉴定［1］用抗结蛋白和抗细胞角蛋白抗体进行间接免疫荧光染色，结果示：抗结蛋白为阳性，胞质中可清楚见中间微丝结构，抗细胞角蛋白和Ⅷ因子相
5、关抗原为阴性，证实为GMC.SKI含药血清制备：)、高(H)剂量组和正常组各2只；按SKI临床推荐用量(0.5gkg-1)的2，4，8倍作本实验的L，M，H剂量，分别为：3.5,7.0和14.0mLkg-1，鼠尾静脉注射给药,每日1次、共7d；正常组动物同时同法给生理盐水7mLkg-1；大鼠活动、进食良好.第7日给药后2h，眼球采血,无菌分离血清，56℃水浴30min并滤菌，置-20℃保存备用.取第3代GMC植入96孔平底培养板(细胞密度5×103/孔)，37℃,50mLL-1CO2培养箱中培养24h；
6、弃上清、加无血清RPMI1640同步24h；分组：SKI低、中、高剂量组（5gL-1,.freel）；分别于刺激培养12,24,36,48和60h收集细胞上清；细胞增殖检测用MTT比色法［2］、FN检测用双抗体夹心ELISA法［3］；用SPSS软件进行重复测量资料的方差分析.2结果2.1SKI对体外培养GMC增殖的影响Baseline组GMC保持平稳增殖趋势,而SKI不同剂量对GMC的增殖均有明显抑制作用，随时间延长,药物剂量加大，抑制作用增强（P0.05），呈剂量依赖关系（Fig1）.◆:Baseli
7、ne;□:SKIH;△:SKIM;○:SKIL.图1SKI对体外培养GMC增殖的时间效应变化（略）Fig1SKIonculturedglomerularmesangialcells（略）2.2SKI含药血清对体外培养GMC增殖的影响不同时间点，Serum组GMC增殖明显，与Baseline组比较有非常显著性差异（P0.01）；12,24和36h,SKI含药血清明显抑制GMC的增殖，呈剂量依赖性，以36h为抑制效应高峰；在36,48h其抑制作用逐渐减弱；在60h抑制作用消失，并显示促增殖作用(P0.05,
8、Fig2）.◆:Baseline;×:Serum;□:SKIHS;△:SKIMS;○:SKILS.图2SKI含药血清对体外培养GMC增殖的时间效应变化（略）Fig2SKIserumonculturedglomerularmesangialcell（略）2.3SKI对体外培养GMC自分泌FN水平的影响SKI3剂量对GMC自分泌FN有明显抑制效应(P0.05,0.01)、呈剂量依赖性，随刺激时间延长抑制效应呈减弱趋势（Fig3）.◆:Basel
