益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节激酶激活的影响

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1、益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节激酶激活的影响作者：孙影，张雪鹏，张健，杨方【摘要】目的观察益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞(glomerularmesangialcell,GMC)增殖及细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinases,ERK)磷酸化的抑制作用。方法将含低、中、高剂量益肾蠲湿合剂的药物血清作用于10%血清-DMEM培养液培养的GMC,分别用MTT和C增殖有明显的抑制作用，并随着剂量的增加作用也逐渐增强。细胞总ERK在各组间无明显差别。但不同浓度的益肾蠲湿合剂均显著地抑制血清所诱导

2、的ERK1/2的磷酸化。结论益肾蠲湿合剂可通过抑制ERK1/2的磷酸化抑制GMC的增殖。【关键词】益肾蠲湿合剂；肾小球系膜细胞；增殖；细胞外信号调节激酶　　Abstract：ObjectiveToobservetheeffectof“Yishenjuanshi”ontheproliferationofglomerularmesangialcells(GMCs)andthephosphorylationofextracellularsignal-regulatedkinases(ERK).MethodsAllherbsin“Yishenjuanshi”m

3、ixtureent,serumfromratseyebloodfreemediumfor48hsandthen10%FSC-DMEMincluding“Yishenjuanshi”todetectGMCsproliferationandexpressionofphosphorylatedERK(p-ERK)byMTTandCproliferationentsarkedlyinhibitedp-ERKexpressionstimulatedbyFCS.Conclusion“Yishenjuanshi”treatmentinhibitsGMCprolife

4、rationviablockingERKphosphorylation.　　Keyixture;Glomerularmesangialcell;Proliferation;ERK　　复方益肾蠲湿合剂是华北煤炭医学院张健教授在多年临床和实验研究的基础上，拟定的治疗各型慢性肾炎的基本方药。本方直接针对慢性肾炎基本发病机理，重用黄芪，辅以枸杞、猪苓等药物，起到补气，滋肾阴、清热、解毒等作用。既往研究表明益肾蠲湿合剂在治疗临床狼疮性肾炎及实验性家兔系膜增生性肾炎取得了良好的效果［1，2］，不但明显缓解了慢性肾炎的临床症状，还全面改善了肾功能，从而延缓肾小球硬化

5、和慢性肾炎的进展。导致慢性肾炎和肾小球硬化的重要原因之一是肾小球系膜细胞(glomerularmesangialcell,GMC)的过度增殖［3］，为此本研究将观察益肾蠲湿合剂对GMC增殖的抑制作用，并进一步探讨其作用机理，从细胞和分子生物学方面探讨其防治肾小球硬化的作用机制。　　1材料与仪器　　1.1益肾蠲湿合剂水煎液由华北煤炭医学院中西医结合医院提供。　　1.2细胞大鼠肾小球系膜细胞(HBZY1)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。　　1.3仪器及试剂超净工作台(美国Formascientificpany)；倒置显微镜(日本Nikon公司)；C

6、O2恒温培养箱(美国Formascientificpany)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司产品)；抗体（p-ERK1/2和t-ERK1/2）（美国CellSignaling）。　　2方法　　2.1含药血清的制备［4］将大鼠随机分为4组，即对照组，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂组。对照组给予等体积的生理盐水，益肾蠲湿合剂以临床成人日用量的10倍作为中剂量，20倍和5倍分别作为高剂量和低剂量。灌胃给药连续7d，第7天重复给药两次，间隔时间2h，并于末次给药后1h后，眼球取血，无菌条件下分离血清，置56℃水浴30min灭活抗体，再经0.2μm滤膜过滤

7、除菌，-20℃保存。　　2.2细胞增殖的测定检测采用四唑盐(MTT)比色法。GMC传代后，制成密度为1.5×104/ml的细胞悬液，加入96孔板内．每孔200μl，置37℃，5%CO2培养箱中孵育24h，吸弃上清液，加入无血清培养液200μl。继续培养48h，使绝大部分细胞处于同步（G0期）。弃上清液，分别加入DMEM培养液（160μl）、血清（20μl）及低、中、高剂量的含药血清（20μl），每组设5个复孔，分别于培养24，48和72h时取出培养板加入MTT20ul(5mg/m1)，继续培养4h，吸弃各孔培养液，加入100μlDMSO，室温避光，轻轻

8、振荡10min，使结晶充分溶解后，酶标仪490nm波长处读取OD值。　　2.3磷酸化ERK1/