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时间:2018-05-02
《抗纤灵冲剂对大鼠体外肾系膜细胞增殖及分泌ecm影响的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、抗纤灵冲剂对大鼠体外肾系膜细胞增殖及分泌ECM影响的研究【关键词】细胞增殖 我们以前的研究证明,中医抗纤灵冲剂对慢性肾功能衰竭(CRF)[1]患者及实验性慢性CRF大鼠肾脏功能和结构损害有明显的改善作用[2],但作用机制尚不清楚,近年来研究表明,肾系膜细胞(MC)、细胞外基质(ECM)及各种细胞因子、生长因子在肾功能进行性减退过程中起着重要作用[3]。本研究采用血清药理学方法和MC体外培养技术,观察了抗纤灵冲剂对大鼠肾系膜细胞增殖和ECM的主要成分纤维联结蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)的影响,并与西医血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺做对
2、照,以期从细胞水平探讨抗纤灵冲剂防治CRF的作用机制,发展中医药防治CRF的理论认识,为进一步提高CRF的中医药诊治水平提供依据。 1材料与方法 1.1实验材料抗纤灵冲剂(KXL)由丹参、大黄、牛膝、桃仁、当归组成,由上海中医药大学附属曙光医院提供,每袋含生药9g;肾组织来源为上海必凯实验动物中心提供的SD大鼠的肾组织,体重为(150±20)g,大鼠肾小球系膜细胞株由长征医院肾科提供(第54代)。对照西药为血管紧张素转换酶抑制剂蒙诺(福辛普利),每粒10mg,由上海中美施贵宝公司提供。定量测定人血清Ⅳ型胶原试剂盒,由中美合资上海华
3、泰生物工程有限公司提供。FM免疫比浊法定量试剂盒:由上海玉兰生物技术研究所提供。培养条件:37℃、5%CO2。RPMI-1640培养基为美国GIBCO产品。胎牛血清(FCS)由上海第二医科大学提供,56℃水浴30min灭活分装,于-20℃冰箱保存备用。 1.2实验方法 1.2.1动物分组SD雄性大鼠56只,每组8只,用Platt法5/6肾切除做大鼠慢性肾衰模型,分两期完成,先背部切口切除左肾2/3,1周后切除整个右肾。假手术组仅背部切口分两次剥离左右肾包膜,保留肾上腺,根据手术后2周所测血肌酐值分组,造模组及治疗组大鼠经统计学处理
4、,使分组后各组血肌酐、尿素氮值无明显差异。分为7组,假手术组(A);假手术加抗纤灵组(B);模型组(C);西药蒙诺对照组(D);抗纤灵组(E)、丹参组(F)、大黄组(G),A、C组用自来水灌胃3ml/d,B、D、E、F、G组按成人常规用量的20倍给药,3ml/d灌胃,实验共进行30天,在最后一次灌胃2h后腹腔静脉无菌采血6ml,分离血清,56℃水浴30min灭活后分装,于-20℃冰箱保存备用。 1.2.2体外培养的大鼠肾系膜细胞(MC)的方法将从液氮中取出的冻存MC按细胞复苏法复苏,传代3次,按MC传代法经胰蛋白酶消化后收集于胰心管
5、内用含20%FCS的1640培养液配成3×104ml细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μl,培养箱中孵育24h后弃去培养液,换1640液继续培养24h,使大部分细胞静止于G期,弃去培养液,然后8孔1组,分别加入含A~G组10%和20%血清的1640培养液(由于条件原因10%B组5孔,20%B组6孔),继续培养72h后,每孔加入噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml)10μl,37℃继续孵育4h终止培养,弃去培养液72h后,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl,振荡10min。于酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(选择波长492nm)。
6、 1.2.3测定大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质、纤联蛋白、Ⅳ型胶原的方法将复苏后传代3次的MC按传代法经胰蛋白酶消化后收集于离心管内,用含20%FCS的1640培养液配成6×104ml悬液转种至24孔板,每孔500μl,继续培养24h,弃去上清,每孔加入含0.5%FCS的1640培养液500μl,继续培养24h,使细胞生长同步。弃去上清,含10%、20%血清的1640培养液A组各5孔,B组各7孔,C组各5孔,D、E组各10%7孔、20%8孔,每孔500μl。培养72h后弃去上清,加入含0.5%FCS的培养液每孔1ml,培养24h,吸取
7、上清,测定纤联蛋白、Ⅳ型胶原含量。 2结果 2.1抗纤灵方对MC增殖的影响与A组比较差异有显著性(P<0.05),说明肾衰血清能明显刺激系膜细胞增殖。与C组比较差异有显著性(P<0.05),说明抗纤灵方及其组方单味药丹参、制大黄能减轻肾衰血清对系膜细胞的刺激,明显抑制系膜细胞增殖,并呈浓度依赖性。蒙诺与抗纤灵作用相似。见表1。 表1抗纤灵对离体大鼠系膜细胞的增殖的影响(略) 2.2抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响见表2。 表2抗纤灵对大鼠肾系膜细胞分泌细胞外基质的影响(略)表2中数据说明肾衰大鼠血清能刺激肾系膜细胞
8、分泌Ⅳ型胶原、纤联蛋白,而且与浓度呈正比。提示肾衰大鼠血清对肾系膜细胞分泌Ⅳ型胶原的刺激作用有随浓度的增高而增高的趋势;而假手术大鼠含药血清组(B组)与假手术大鼠对照组(A组)无明显差异。10%、20%浓度能抑制肾衰大鼠
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