尿毒症患者血清对大鼠系膜细胞增殖的影响

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1、尿毒症患者血清对大鼠系膜细胞增殖的影响-->[摘要]取尿毒症患者血清,稀释成不同浓度,体外培养大鼠系膜细胞(MC),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期,免疫细胞化学法检测C-jun蛋白表达。发现不同稀释浓度尿毒症患者血清抑制大鼠MC增殖,具有浓度和时间依赖性;并促使S+G2/M期细胞减少,G0~G1期细胞增多;明显抑制C-jun蛋白的表达(P①慢性肾衰竭已成为我国的常见病和多发病,随着对其研究的加深,许多新的毒素被发现,甲状旁腺激素(PTH)作为一种尿毒症的新型毒素,其负性作用广泛而突出,近年来日益受到重

2、视。系膜细胞(MC)是肾小球中主要固有细胞之一,MC的过度增生与凋亡失衡以及由此引起的细胞外基质(ECM)的过量生成和聚积是导致肾小球硬化的主要原因。本研究旨在观察尿毒症患者高PTH血清及正常PTH血清对体外培养的大鼠MC增殖的影响,并探讨其可能的机制。1材料和方法1.1材料大鼠MC株由本科肾病实验室建立[1],四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Amresco产品,RPMIl640培养液为Gibco公司产品,兔抗大鼠C-jun单克隆抗体及ABC免疫试剂盒为武汉博士德公司产品,其他试剂均为Sigma公司产品及进口分析纯。酶标仪(ThermoMK3

3、),流式细胞仪(库尔特公司,EPICS-XL),MCYCLE软件(库尔特公司),IDA-2000图文分析软件(北京中科院空海电子技术公司)。1.2血清制备每组均男2例,女1例。正常健康对照组:选自健康体检者,平均年龄(38.33±6.55)岁。尿毒症患者[平均年龄(66.33±6.02)岁]血清:选取年龄、病程相近,血压控制良好,无明显感染、无糖尿病的慢性肾小球肾炎患者,分为正常PTH血清组(A)和高PTH血清组(B),SCr分别为(501±153.46)、(536.67±155.

4、47)μmol/L,BUN分别为(14.03±5.15)、(32.07±7.88)μmol/L,PTH分别为(32.2±2.13)、(487.5±23.21)ng/L。均在无菌条件下留取、分离,-20℃保存备用。1.3对大鼠MC增殖的影响取对数生长期MC接种于96孔板(1104/孔),10%小牛血清RPMI1640培养液培养24h,换无血清RPMI1640培养液继续培养24h,使细胞生长同步并进入休止期。弃上清,加入含不同稀释浓度(10%、20%)血清的RPMI1640

5、培养液分别作用24、48h(每组设9个复孔),经锥虫蓝染色,活细胞达95%以上,于刺激结束前4h,加入MTT(5g/L),酶标仪参考波长690nm,读数波长492nm处读取光密度(D)值。均重复3次。1.4对大鼠MC细胞周期的影响同法处理细胞,用20%的各组血清作用48h后,胰酶消化,PBS清洗,70%预冷乙醇悬浮固定细胞,-20℃过夜。加入等量PBS再洗2遍,碘化丙啶避光显色,上流式细胞仪检测,MCYCLE软件分析细胞周期。1.5C-jun表达的免疫细胞化学检测取对数生长期细胞,制备成细胞悬液,接种于盖玻片上,制成细胞爬片,用含20%

6、的各组血清RPMI1640培养液作用48h,PBS漂洗,冰丙酮固定,用ABC法进行免疫细胞化学检测,DAB显色,苏木精复染细胞核。以PBS为一抗作空白对照,以博士德公司提供的人肿瘤细胞切片作阳性对照。光学显微镜下观察,摄片,结果判断:(1)阴性:细胞核着淡蓝色为阴性细胞;(2)阳性:细胞核着浅棕黄色;(3)强阳性:细胞核着深棕黄色。IDA-2000软件分析MC的平均D492值,每片随机取5个视野。1.6统计学处理实验数据均以x-±s表示,用SPSS软件进行数据分析,组间比较用方差分析。2结果2.1尿毒症患者血清对大鼠MC增

7、殖的影响不同稀释浓度的尿毒症患者血清均抑制MC增殖,且呈时间及剂量依赖关系;高PTH组抑制作用显著高于正常PTH组2.2尿毒症患者血清对MC细胞周期的影响20%稀释度的尿毒症血清刺激MC48h可使G0~G1期细胞增多,S+G2/M期细胞减少,G2期变化不明显2.3尿毒症患者血清对MCC-jun表达的影响尿毒症患者血清(20%)处理MC48h后,C-jun的表达均较对照组明显减弱,尤其高PTH血清明显抑制C-jun的表达。经IDA-2000数码图像分析系统软件分析,对照组C-jun平均D492值为0.5983±0.0317,

8、尿毒症正常PTH血清组为0.5071±0.0363,高PTH血清组为0.4105±0.0434,与对照组相比均差异显著(P3讨论无论是免疫性和非免疫性病因,一旦肾脏损害发生,尽管