双黄连粉针剂对小鼠t淋巴细胞体外活化与增殖的影响

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1、双黄连粉针剂对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响【摘要】目的:探讨双黄连粉针剂（以下简称SHL）对小鼠T淋巴细胞的体外活化和增殖的影响。方法:MTT法检测SHL对小鼠淋巴细胞的毒副作用;双色荧光抗体染色技术结合流式细胞术分析SHL对小鼠T淋巴细胞在多克隆刺激剂(ConA)刺激下体外活化抗原CD69表达的影响;MTT法以及羧基荧光素乙酰乙酸(CFDASE)标记技术结合流式细胞术分析SHL对小鼠T淋巴细胞在ConA诱导下体外增殖的影响。结果:SHL对小鼠淋巴结的淋巴细胞毒副作用非常小;终质量浓度为60、80、

2、100、120mg/L的SHL对ConA刺激下的T淋巴细胞体外活化抗原CD69表达具有抑制作用(P<0.01);MTT法和CFDASE染色法都显示,终质量浓度为60、80、100、120mg/L的SHL对ConA诱导的T淋巴细胞增殖作用具有明显的抑制作用(P<0.01)。结论:SHL对小鼠T淋巴细胞的体外活化和增殖具有明显的抑制作用。【关键词】双黄连粉针剂T淋巴细胞体外活化增殖　　双黄连是由金银花、黄芩、连翘三味中药提取的无菌粉针剂,临床上主要用于治疗病毒性肺炎以及细菌性和病毒性上呼吸道感染［

3、1］。目前对双黄连的研究主要集中在其抗菌、抗病毒以及临床应用等方面［2-4］。病原体的清除与免疫系统有十分密切的关系,因此我们推断双黄连可能参与了免疫调节过程,有关双黄连对免疫细胞影响的研究鲜有报道。本实验我们从免疫学角度探讨双黄连粉针剂(SHL)对小鼠淋巴结的T淋巴细胞体外活化和增殖的作用,阐述其免疫作用机制。　　1材料和方法　　1.1材料清洁级BALB/c小鼠购自广东省实验动物中心;SHL为哈药集团中药二厂生产(批号:0305001,国药准字Z10960058,600mg/支)。PBS配制成200g/L

4、存储液,无菌分装,-20℃贮存。刀豆蛋白A(ConA)、四甲基噻唑盐(MTT)、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司;鼠抗CD3PE(phycoerythrin藻红蛋白,质量浓度0.2g/L)和CD69FITC(fluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素,0.25g/L)购自美国Pharmingen公司;RPMI1640、L谷氨酰胺、青霉素、链霉素、β二巯基乙醇、胎牛血清等购自美国GibcoBRL公司;CFDASE(carboxyfluoresceindiacetat

5、e,succinimidylester)购自美国MolecularProbes公司;流式细胞仪(FACSCalibur)购自美国BD公司。　　1.2方法　　1.2.1淋巴细胞悬液制备颈髓脱臼处死小鼠,无菌条件下分离颈部、腋下、腹股沟以及肠系膜淋巴结,200目筛网研磨过滤,PBS洗涤2遍(250g,5min),收集细胞。　　1.2.2淋巴细胞培养用RPMI1640完全培养液重悬细胞,配制成密度为2×109/L的细胞悬液。接种于96孔板每孔200μL细胞悬液,与不同浓度的SHL(终浓度为60、80、100、12

6、0mg/L)在37℃、50mL/LCO2培养箱孵育4h。　　1.2.3MTT法检测SHL对淋巴细胞的药物毒性按1.2.2方法在96孔板中接种200μL2×109/L的细胞悬液,实验设空白组（只加200μL的培养液）、对照组（只加200μL的细胞悬液）、实验组（细胞悬液中加入不同浓度的SHL,终质量浓度分别为60、80、100、120mg/L）。每组10个复孔(37℃、50mL/LCO2),培养48h后,每孔加入20μLMTT,避光孵育4h后,离心(300g,5min)弃上清,每孔加入100μL的DMSO,震

7、荡10min溶解孔底紫色结晶后,在酶标仪上于490nm波长检测各孔吸光值,并计算各孔细胞的相对存活率。存活率=［（A实验组－A空白组）/（A对照组－A空白组）］×100%。　　1.2.4MTT法检测淋巴细胞增殖1.2.2方法中的96孔板细胞加入10μL的ConA（ConA终质量浓度为5mg/L）,实验设单加ConA的对照组,每组6个复孔(37℃、50mL/LCO2)培养48h后,每孔加入20μLMTT,4h后离心(250g,5min)弃上清,每孔加入100μL的DMSO,溶解紫色结晶,酶标仪490nm波长检

8、测A值,并按下式计算各浓度（60、80、100、120mg/L）SHL对小鼠淋巴细胞的增殖抑制率。抑制率=［1－（A药物/A对照）］×100%。　　1.2.5免疫荧光双染色检测T淋巴细胞体外活化1.2.2方法中孵育4h后的细胞,实验设阴性对照组、阳性对照组（加入ConA终质量浓度为5mg/L）以及基于ConA刺激下的不同浓度的SHL干预组,每组3个复孔(37℃、50mL/LCO2),培养8h后收集各孔细胞,加PB