磷脂酰肌醇3激酶途径在哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

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1、磷脂酰肌醇3激酶途径在哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用：吴立琴，戴元荣，夏晓东【摘要】　　目的：观察哮喘大鼠肺组织中p-Akt、p-p70S6K含量变化，探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号转导途径在哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖中的作用。方法：SPF级健康雄性SD大鼠36只，随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）和annin干预组（C增殖。【关键词】哮喘大鼠气道重塑信号转导平滑肌细胞　　Abstract:Objective:Toobservethechangesofp-Akt，p-

2、p70S6Kinlungtissuesofasthmaratandtoevaluatetheroleofphosphoinositide3-kinasesignalpatha.Methods:Thirty-sixmaleSprague-Dalydividedintothreegroupsonaverage，includingcontrolgroup(groupC)，asthmagroup(groupA)andannintreatedgroup(groupCsproliferation，plica

3、testhatPI3KsignaltransductionpathportantroleintheASMCsproliferationofasthma.　　Keya；rat；airodeling；signaltransduction；smoothmusclecell　　哮喘患者的气道重塑主要包括气道平滑肌细胞(airoothmusclecells，ASMC)增生/肥大、基底膜增厚、血管生成等，其中最明显的是ASMC的增生和肥大[1]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在ASMC增殖中的作用最近有初步

4、阐明，但其是否介导哮喘ASMC增殖尚不明确。我们通过复制大鼠慢性哮喘模型，研究PI3K的下游信号分子Akt、p70S6K活性变化，并予PI3K特异性抑制剂annin干预，探讨PI3K信号途径在哮喘ASMC增殖中的作用。　　1材料和方法　　1.1实验动物SPF级健康雄性Sprague-Daa公司产品，annin为Biomol公司产品，兔抗大鼠磷酸化Akt多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均为美国CST产品，兔抗大鼠p70S6K多克隆抗体、兔抗大鼠磷酸化p70S6K多克隆抗体及兔抗大鼠β-a

5、ctin多克隆抗体均为SantaCruz产品。　　1.3哮喘大鼠气道重塑模型复制SPF级雄性健康SD大鼠36只，随机分为3组（n=12），分别为：正常对照组（C组）、哮喘组（A组）以及annin（L，第8天以相同剂量、相同方法加强致敏1次；致敏后第15天开始予1%OVA雾化吸入刺激，每周3次，每次30min，连续8周。C组则代以生理盐水致敏和激发大鼠；age-Proplus6.0医学图像分析软件，在200倍光镜下，每只大鼠挑选3支有完整横断面的中小支气管，参照文献[4]关于气道各层定义寻找标志，

6、测量支气管基底膜周径(Pbm)、支气管总面积（1）、平滑肌内缘内气管面积（2）。计算标准化总管壁厚度（，标准化平滑肌厚度（）为（1璚am2）/Pbm[5]。最后计算3个Pbm、数据平均值作为该标本代表值。　　1.5Westernblot法测定肺组织p-Akt及p-p70S6K提取细胞总蛋白质，以BCA法进行蛋白定量。按每孔100μg蛋白量加样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离的蛋白转膜至PVDF膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加兔抗大鼠p瑼kt多克隆抗体(1:1000)或兔抗大鼠β-acti

7、n抗体(1:1000)，于4℃过夜。以三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBS）洗膜后加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（1:2000），于室温孵育1h，洗膜，用ECL显影。用QuantityOne凝胶软件分析系统分析p-Akt蛋白和内参β-actin光密度值，以目的蛋白p-Akt条带光密度和内参β-actin光密度比值代表p-Akt的光密度值。WesternBlot检测p-p70S6K蛋白时，一抗孵育分别予兔抗大鼠p70S6K及p-p70S6K多克隆抗体，以p-p70S6K条带光密度和p70S6K光密度比值

8、代表p-p70S6K的光密度值，其余步骤均同p-Akt。　　1.6统计学处理方法组间比较采用单因素方差分析，进行方差齐性检验，方差齐者用LSD，方差不齐者用Dun’sT3法检验。两变量的相关程度用直线相关分析法分析。　　2.3各组大鼠肺组织p-Akt蛋白和p-p70S6k蛋白表达情况A组大鼠肺组织p-Akt表达量较C组升高，C增殖在哮喘气道重塑中发挥了重要作用。研究发现哮喘患者气道平滑肌层明显增厚，致死性和非致死性哮喘患者气道平滑肌面积分别增加50%～230%和25%～150%[6]。本实验观察