谈补肾复方对去卵巢大鼠mek1、erk2基因表达的调控作用

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1、谈补肾复方对去卵巢大鼠MEK1、ERK2基因表达的调控作用骨质疏松症是常见的骨代谢疾病，分为原发性、继发性和特发性3类。以骨量减少、骨组织结构破坏、骨脆性增加和易发生骨折为特征的疾病，是老年人的多发病，随着人口的老龄化，日益受到人们的重视。绝经后骨质疏松症属于原发性骨质疏松症，是更年期妇女的常见全身性骨代谢疾病，体内雌激素水平下降是其重要病因。目前，对于绝经后骨质疏松症，中医药预防和治疗相关研究进展较快，中医学认为，骨质疏松症与肾虚、脾虚、血瘀有着密切的关系，其中肾虚是绝经后骨质疏松症的主要原因。本实验应用补肾中药复方(鹿茸、牡蛎、淫羊藿)低、中、高剂量组，探讨补肾中药防治骨质疏松症的的

2、机理，为开发中药防治骨质疏松症提供实验依据。　　1材料和方法　　1.1主要仪器与试剂　　DEXA骨密度(BMD)仪(美国GE-Lunar);实时荧光定量PCR仪(ABI，USA);多功能酶标仪INFINITEM200(奥地利TECAN);血骨钙素试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶测定试剂盒酶联免疫试剂盒(RB公司);RNAisoReagent、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶，EasyDilution稀释液均购自TaKaRa公司;引物自行设计合成。　　1.2实验药品及制备　　实验药品:补肾中药复方:淫羊藿提取物，马鹿鹿茸(辽宁清原鹿场)，冻干，脱毛，切片，粉碎，过80目筛。牡蛎(长山岛大连湾牡蛎

3、)，洗净，晒干，应用纳米技术制备，平均粒径720um。中药复方制备:淫羊藿提取物、鹿茸微粉与牡蛎微粒，混合即得。对照药物:盖天力片:东盛科技启东盖天力制药股份有限公司，国药准字H32025396，产品批号AJ192。　　1.3实验动物及模型建立　　实验选用SPF级SD雌性大鼠92只，体重250±50g，4～5月龄，未曾交配，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(实验动物质量合格证明号:1100170659)。造模方法:除正常组外，大鼠经10%水合氯醛(3ml/kg)肌肉注射麻醉，将麻醉后大鼠以俯卧位固定，从腰背部脊柱两侧纵行切口切开皮肤及肌肉，摘除两侧卵巢组织后逐层缝合，

4、关闭创口。术后3日，常规给予青霉素预防感染。　　1.4动物分组与给药　　按随机数字表分出正常组(9只)。其余大鼠手术:假手术组14只，腰背部脊柱两侧纵行切口缝合，不摘除卵巢组织;去卵巢组73只。术后7d将去卵巢组存活者按体重随机分为5组(每组14只左右):模型组(13只，切除卵巢后不给予补肾中药复方)，补肾中药复方低、中、高剂量组(切除卵巢后给予补肾中药复方低、中、高剂量灌胃)，盖天力组(13只，切除卵巢后给予盖天力灌胃)。术后7d各组动物分别给予以下灌胃处理:正常组、假手术组自由饮水，模型组均给予0.9%氯化钠注射液0.875ml/100g体重;补肾中药复方低剂量组给药量0.227g/

5、(kgd);补肾中药复方中剂量组给药量0.908g/(kgd);补肾中药复方高剂量组给药量0.454g/(kgd)，各组灌胃12周。标本采集与保存:灌胃处理12周后采集标本。血液采集:腹主动脉取血法采集大鼠血液，离心后收集上清，-80℃冰箱保存。骨骼标本采集:在无菌条件下迅速剥取其双侧股骨，剔尽软组织，左侧股骨用0.9%氯化钠注射液浸湿的纱布包裹，右侧股骨加入trizol-80℃冰箱保存，待测骨密度。　　1.5血生化指标测定　　采用ELASA方法在酶标仪上测定血清骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)水平，具体操作均按照试剂盒说明书完成。　　1.6骨密度检测　　各组大鼠在灌胃处

6、理12周后用10%水合氯醛(3ml/kg)肌肉注射麻醉，待其呈稳定麻醉状态，置于DEXA骨密度仪测定的左侧股骨骨密度值。　　1.7RT-RealTimePCR分析　　将冷冻的右侧股骨迅速研磨后提取骨组织中的总RNA，RT-RealTimePCR方法检测MEK1及ERK2mRNA的表达水平。总RNA的提取采用TRIzol一步法，紫外分光光度计检测浓度，并用1%甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性，调整总RNA的浓度至500ng/μL，取2μL将其逆转录为cDNA。逆转录体系、PCR扩增体系及反应条件均参照试剂盒中的说明书设定，以标本中所提取的高浓度RNA逆转录得到的cDNA作为标准品

7、，经10倍梯度比例稀释后，进行PCR反应制备标准曲线。反应结束后，根据自动生成的标准曲线，计算出待测样本中管家基因和目的基因的准确含量。以同一样本中，目的基因与管家基因含量的比值作为评价目的基因表达水平的指标。所用引物根据GenBank所发布的序列自行设计并合成。　　1.8统计学分析　　测定结果均以珋x±s表示，采用SPSS10.0软件处理数据，单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1