清热复方对热休克大鼠肝、肺组织热休克蛋白基因表达的调控作用论文

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1、清热复方对热休克大鼠肝、肺组织热休克蛋白基因表达的调控作用论文王洪琦，邹素芬，李建国【关键词】热证／中药疗法摘要：【目的】探讨清热复方对大鼠热休克蛋白70(HSP70)表达的调控作用。【方法】将70只大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组和正常对照组7组，每组10只。采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对热休克模型组、内毒素模型组和正常对照组大鼠的肝、肺组织进行了HSP70mRNA表达的检测，观察清热复方白虎汤和黄连解毒

2、汤分别对两种模型大鼠肝、肺组织HSP70mRNA表达的影响。【结果】热休克模型组、热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组中HSP70mRNA的表达高于正常对照组（Ｐ＜００５）；热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组均高于热休克模型组（Ｐ＜００５）；内毒素模型组、内毒素加白虎汤组和内毒素加黄连解毒汤组之间的HSP70mRNA表达以及与正常对照组相比均无显著性差异（Ｐ＞００５）。【结论】提示不同因素导致的热证状态下HSP70的基因表达不一致，清热复方可诱导热休克大鼠肝、肺组织中HSP70表达的增加，从而

3、提高细胞的耐受力，避免细胞组织的损伤。关键词：热证／中药疗法；白虎汤／药理学；黄连解毒汤／药理学；热休克蛋白70；疾病模型.freelL，相当于生药1g/mL；黄连解毒汤(黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g)，每剂水煎浓缩至30mL，相当于生药1g/mL，4℃保存备用。主要试剂：总RNA提取试剂盒和逆转录PCR反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司提供)；RTＰＣＲ引物(Canada,StressGenCorp,STM507);βaction引物(上海生工生物工程公司提供)；DL2000DNAMar

4、ker(大连宝生物工程有限公司提供)。13主要仪器ＴＧＬ16G型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；DNA／RNA纯度检测仪(GeneQuantAmericanPharmaciaBiotechCorp)；PE9600型PCR扩增仪(AmericanPerkinCorp)；EDAS120电泳凝胶图象分析系统(AmericanKodakCorp)。14动物分组及处理70只雄性SD大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组、

5、正常对照组7组，每组10只。141热休克组大鼠模型的制备与处理将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg)，1h后进行第2次灌胃，再经1h将大鼠置恒温烤箱中进行热休克处理，参考Cruiie方法［2］，温度控制在约55℃，测量大鼠肛温达到42℃，维持10～15min，密切观察大鼠动态，大鼠出现烦躁、乱窜动、毛发竖立、爪底湿润后，断头处死，取肺、肝组织备用。142内毒素组大鼠模型的制备与处理将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg),1h后于尾静

6、脉注射内毒素(15mg/kg)，1h后再重复灌胃，3h后观察大鼠出现烦躁、乱窜动后，断头处死，取肺、肝组织备用。143正常对照组生理盐水灌胃，不经其他任何处理，断头处死，取其肝、肺组织备用。15实验方法采用ＲＴＰＣＲ法检测各组大鼠肝、肺组织中HSP70mRNA的表达。βaction引物序列：SensePrimer5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′；AntisensePrimer5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′。HSP70引物序列：SensePrimer5′CTCCAGC

7、ATCCGACAAGAAGC3′；AntisensePrimer5′ACGGTGTTGTGGGGGTTCAGG3′。βaction扩增片段长度为450个碱基对(basepair,bp)，HSP70扩增片段长度为234bp。ＲＴＰＣＲ反应体系组成：MgCl２60μL，10×ＲＮＡＰＣＲＢuffer80μL,TaKaRaLATaq05μL，HSP70上下游引物各1μL，βaction上下游引物各1μL，RnaseFreedH2O615μL，总反应体积为80μL。PCR扩增反应条件为：前预变性94℃2mi

8、n，1个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环；后延伸15min。取出反应液约10μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，将电泳结果置于EDAS120电泳凝胶图象分析系统内扫描并摄片。采用Gelbase电脑软件对HSP70DNA与βactionDNA条带进行光密度扫描，计算HSP70DNA和βactionDNA吸收峰面积之比，即Ｄ值，以此估计HSP70mRNA的表达情况。16统计学处理用SPSS100软件进行多组间两两比较。2结果各