光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响论文

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1、光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响论文【摘要】目的：研究光气吸入染毒前后大鼠肺组织基因表达的差异，探讨光气肺损伤作用相关的基因谱.方法：提取正常对照组和光气染毒组肺组织的总RNA，并以此为模板制备荧光标记的cRNA靶物，经杂交、洗涤后，通过扫描荧光强度和计算机软件分析，寻找染毒前后上调和下调的差异表达基因.结果：在大鼠20500个靶基因中，初步筛选出801条差异表达基因，表达上调的有557条.freelg/L，1min）.4h后分别将两组动物按20mg/Kg用10g/L戊巴比妥钠麻醉，充分暴露胸

2、腔，左心房开放后经右心室沿肺动脉注入无RNA酶的水对肺组织进行灌洗以尽量排尽血液，最后在肺的同一部位剪取肺组织，经TRIzol处理，迅速置于液氮中保存.1.2.2总RNA提取和cRNA扩增标记用RIzol试剂一步法抽提细胞总RNA，并用甲醛凝胶电泳，检测总RNA样本的质量；用紫外分光光度计，分别在260nm，280nm处检测cRNA的产量和纯度.用cRNA扩增与标记试剂盒对靶物进行Cy3或Cy5荧光标记，用RNA纯化试剂盒对标记靶物进行纯化，分别在550nm，650nm处检测Cy3和Cy5的荧光强

3、度，以评估荧光标记效率.1.2.3芯片杂交实验芯片探针长度60mer，共包括22575个样点，其中覆盖大鼠基因20500个，positivecontrol探针913个，negativecontrol探针162个，空白探针1000个.按照芯片杂交试剂盒提供的操作标准，将芯片和cRNA荧光标记靶物进行杂交.经洗涤后，室温500r/min离心10min，甩干芯片表面液体，取出后立即进行扫描.1.2.4荧光扫描和数据处理将清洗甩干的芯片置于Axon4000B型扫描仪中，用Genepix3.0软件进行图像扫

4、描，得到芯片杂交图谱，读取每个样点的原始荧光信号数据，并对读取的数据用Spotfire8.0软件进行分析，经归一化处理后，制作基因差异表达分析散点图.导出上调基因和下调基因列表.判断基因差异表达的标准：当R≥2时表示基因上调；R≤0.5时表示基因下调；当0.51.2.5基因功能分类对符合基因差异上调或下调表达标准的单个基因，通过连接基因库权威网站：.ncbi.nlm.nih.gov和.geneoncology.org，进行基因功能比对和分类，制作光气染毒后肺组织的差异表达基因图谱.2结果2.1总R

5、NA提取质量RNA甲醛凝胶电泳显示，28s，18s两条带清晰完整，证实提取的RNA无降解（图1）.经紫外分光光度计分析，A260nm/A280nm值均为2.0，说明制备的RNA纯度较高，符合实验要求.2.2cRNA标记效率以效率大于8μmol/g视为标记有效，计算得荧光标记效率分别为9.81μmol/g和9.04μmol/g，符合参加杂交反应的条件.2.3芯片杂交结果2.3.1差异表达基因经对双色荧光标记杂交扫描图谱和基因表达分析散点图进行基因差异表达分析，在大鼠20500个靶基因中，染毒组相对于

6、对照组上调的基因有557条，其中已知基因433条，未知基因124条；下调的基因有254条，其中已知基因205条，未知基因49条.部分显著变化的基因（表1）.表1光气染毒后肺组织的部分差异表达基因（略）2.3.2基因功能分类经基因生物学功能分析，将差异表达基因分为9类，其功能已知基因分类结果显示，光气染毒后细胞的能量生成下降，包括：参与糖有氧代谢的基因表达下调，如NM＿033235，编码苹果酸脱氢酶1；而参与糖异生和糖无氧酵解的基因表达上调，如BI277389，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1.与能量水平

7、密切相关的部分功能基因也表达异常，如NM＿053578基因下调，编码ATP酶H+转运溶酶体9kDaV0亚基e，参与ATP合成偶联的质子运输；NM＿022235基因上调，编码钾电压阀门通道Isk相关家族成员3，参与K离子转运等（表2）.表2差异表达基因的分类及数目（略）3讨论近年来，光气作为重要的化工原料，在生产、运输、使用等过程中，对人员和环境造成了严重危害［6］.光气吸入中毒最显着的临床表现是肺水肿的形成，也是中毒人员致死的主要原因.我们利用基因芯片技术，对光气染毒前后的基因表达谱进行

8、了分析.从差异基因数量来看，差异表达在两倍以上的基因达801条，占靶基因总数的3.9%，说明光气可以引起肺组织基因的多发性改变，证实了光气致肺水肿的发生、发展是一个多基因调控的过程［7］，提示在正常肺组织细胞中可能存在着相当数量的基因容易受到有毒化学物的作用而发生改变，其基因表达是一个复杂而又不稳定的生物学过程，有人称之为“不稳定型基因组”［8］.表1所列出的部分变化显著的功能基因可能是光气毒性作用的敏感基因或靶标基因.从差异基因功能来看，很大一部分差异表达基因与细胞的基本生理功能