健脾化瘀方对人肝癌细胞ras-mapk通路的影响

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1、健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/MAPK通路的影响【关键词】健脾化瘀方；RTPCR；ras/MAPK　　【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofJianpiHuayuRecipeonras/MAPKsignalingpathanhepatomacell.MethodsThegeneexpressionethodandgelelectrophoresisanalysissystem.ResultsERK,sos1,cfosgeneexpressionanhepatomacellandindu

2、cetheapoptosisbyinhibitingtheexpressionofgeneERK,sos1,cfosoftheras/MAPKsignalingpathl蒸馏水加热回流提取2次，每次1小时，合并提取的药液，微波真空干燥。配制成相当于生药浓度1g/ml的药液灭菌备用，实验时配制为6mg/ml浓度。　　2.实验方法　　(1)细胞准备：取处于对数生长期的人肝癌细胞SMMC7721，以5×105个/ml密度接种于直径6cm的培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养24h以使细胞贴壁，弃原培养液，加入健脾化瘀方终浓

3、度为6mg/ml的含10%小牛血清的DMEM培养液，继续培养48h后，用PBS洗2次，每皿加1mltrizol，反复吹打后收集细胞于EP管中。立即使用或-70℃保存待用。以对数生长期肝癌细胞SMMC7721为对照。　　(2)RNA制备：每皿1mlTrizol提取的细胞后，每ml加入200μl氯仿，静置10min后离心，取上清移至新EP管，加入等体积异丙醇，室温放置10min后离心，弃上清沉淀即总RNA。每管加入1ml75%乙醇（用DEPC处理过的水配制），离心5min倒掉乙醇，室温晾干，加入20μlDEPC处理水，吹打混匀

4、，随即使用或-70℃保存待用。　　(3)RNA质量鉴定：取2μlRNA加入500μlDEPC水中，在紫外分光光度仪上测定RNA样品在260nm和280nm处的吸光度(OD)值。OD260与OD280比值在1.8～2.0之间，表明无RNA降解。2%琼脂糖凝胶40～60V预电泳10　min后，60V电压电泳至溴酚蓝迁移到凝胶的3/4处;紫外灯下观察18S和28S带情况，可见28S的宽度及亮度约是18S的两倍，边缘清晰，表明完整性较好，可用于RTPCR。　　(4)逆转录：采用TaKaRa逆转录试剂盒，按照说明书操作。37℃孵育1

5、5min，85℃5s灭活反转录酶，4℃结束，取出低温保存。　　(5)聚合酶链式反应：采用TaKaRaPCR试剂盒，按照说明书操作。扩增条件：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，循环32次（SOS1：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，循环32次）。RTPCR引物设计见表1。表1RTPCR实验引物设计（略）　　(6)电泳凝胶分析：2%琼脂糖凝胶电泳，电压55V，时间35min。采用TanonGIS2010凝胶成像分析系统对琼脂糖凝胶进行吸光度扫描，测量条带的灰度强弱。结果以目的基因和β

6、actin的积分吸光度比值表示。以上实验均重复3次。　　3.统计学分析　　统计分析采用SPSS13.0软件包进行数据处理，所有数据均用均数±标准差（-±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。　　结果　　健脾化瘀方对人肝癌细胞株SMMC7721作用48h后，通过RTPCR和凝胶电泳，利用凝胶电泳成像分析系统扫描条带的积分吸光度值，并与同管扩增的βactin条带积分吸光度做比值，代表基因表达的量。实验结果为：ERK、SOS1、cfos基因表达较对照组低，ERK、SOS1各浓度组与对照组比较差异有显著的统

7、计学意义（P＜0.01），cfos高浓度组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；见表2。MEK、Raf、Ras、Grb2基因的表达与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。凝胶电泳图见图1。表2健脾化瘀方作用肝癌细胞后相关基因产物凝胶电泳条带吸光度比值（略）　　讨论　　MAPK经典的信号转导过程包括：细胞外信号→酪氨酸蛋白激酶受体（receptorproteintyrosinekinase，RPTK/RTK）→含有SH2结构域（Scrhomology2domain）的接头蛋白（如GRB2）→鸟嘌呤核苷酸释放因

8、子（如sonofsevenless，SOS）→Ras蛋白→丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK，如Raf）→丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK，如MEK1/2）→MAPK（如ERK1/2）→转录因子→DNA合成。MAPK家族包括ERK、JNK和p38MAPK。其中ERK在MAPK途径中