蛇葡萄素（amp)对spca1细胞增殖的抑制作用

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1、蛇葡萄素（AMP)对SPCA1细胞增殖的抑制作用：吴建军任润珍刘凯刘永琦吴勇杰【摘要】目的检测蛇葡萄素(Ampelopsin，Amp)对人小细胞肺癌细胞(SPCA1)的细胞毒性，并初步探讨其作用机制。方法采用MTT比色法检测Amp（12.5～200μg/ml)对SPCA1细胞的增殖抑制作用。应用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率和细胞周期变化。用HE染色和透射电镜观察蛇葡萄素单用和与卡铂联用引起的人SPCA1的形态学变化。应用共聚焦显微镜检测Amp（50，100μg/ml)对SPCA1细胞内Ca2＋、H＋和线粒体膜电位的影响。结果Amp以浓度、时间依赖性地抑

2、制SPCA1细胞的增殖，以浓度依赖性地引起细胞凋亡率的升高，使细胞周期阻滞于G2/M期。Amp（100μg/ml)有诱导细胞凋亡的作用,出现明显的凋亡晚期特征即凋亡小体。与对照组比较，Amp引起细胞内Ca2+、H+浓度升高和线粒体膜电位降低。结论Amp可抑制SPCA1细胞增殖，同时诱导凋亡发生，此作用可能与细胞阻滞于G2/M期、Ca2＋和H＋升高有关。【关键词】蛇葡萄素(Amp)；SPCA1细胞；增殖抑制　　黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛地存在于药用植物的根、叶、皮、果实中，以游离或与糖结合为苷的形式存在〔1〕。该类化合物不仅种类数量繁多，而且结构复杂

3、多样，表现出多种生理活性〔2〕。蛇葡萄素(Amp)属于小分子黄酮类化合物，是指两个苯环通过中央三碳链相互连结而成的C6C3C6化合物〔3〕。研究证实，Amp对酪氨酸激酶有强烈的抑制作用〔4〕，并在一系列的抗肿瘤实验中得以体现〔5〕。本实验研究了Amp对小细胞肺癌（SPCA1)细胞增殖的抑制作用，并初步探讨其作用机制，为Amp在临床上的最终开发应用提供了依据。　　1材料与方法　　1.1材料与仪器　　Amp由广东泰禾医药科技有限公司(040513)提供，纯度97%以上；SPCA1细胞由兰州大学药学院药理学教研室提供；注射用卡铂，购自齐鲁制药有限公司(04100

4、161)；RPMI1640培养基，购自Invitrogen公司；新生牛血清，购自杭州四季青公司；噻唑蓝（MTT)、碘化丙啶（PI)，Sigma公司；荧光探针均购自MolecularProbe公司。其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱，Shellab公司；相差倒置显微镜，Olympus公司；ELX180酶标仪，BLOTEKInstruments公司。　　1.2方法　　1.2.1分组和给药方法　　取对数生长期细胞，细胞数为4×104/ml，加入96孔细胞培养板，分为对照组、试验药物组、阳性药物组，24h后分别加入5%的DMSO、Amp（12.5～200μg/ml

5、)、卡铂。　　1.2.2Amp对SPCA1细胞的抑制作用　　依上法处理细胞，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下分别培养48、72h，每孔加入10μlMTT（5mg/ml),4h后每孔加入10%的十二烷基硫酸钠(SDS)100μl，充分振荡，用酶标仪在570nm处测定OD值，计算抑制率。抑制率(IR)=〔1-(用药孔平均吸光度)/(对照孔平均吸光度)〕×100%。　　1.2.3Amp对SPCA1细胞凋亡和细胞周期的影响　　将对数生长期的SPCA1细胞用不含血清的新鲜培养液培养8h，使细胞停止增殖。处理、收集细胞，PBS洗三次，充分制悬细胞，用70%的冷乙醇进

6、行固定。测定时冷PBS洗三次，收集细胞加入含有核糖核酸酶(RNase)的PI（50mg/L)溶液0.5ml（细胞浓度＞106/ml)，室温下避光30min后用流式细胞仪检测细胞凋亡及各期细胞百分率。　　1.2.4透射电子显微镜检查　　37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养到24h细胞完全贴壁后加药。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养48h后,收集培养液离心(1000r/min),弃上清，保留细胞沉淀待用；消化各组培养瓶中的细胞,按实验分组一一对应，与培养液中收集的细胞沉淀混合，再次离心(1000r/min)，弃上清液。用PBS液轻轻吹洗收集的细胞转移至Ep

7、pendorf管中，再洗1次后，再次离心(1000r/min)，并弃上清液。细胞沉淀中加入5%的戊二醛固定液，4℃保存待检。将固定的细胞离心，用PBS清洗2遍，弃上清液，加入1%锇酸于沉淀中固定1h。丙酮梯度脱水，将细胞置于丙酮∶包埋剂（1∶1)中置换30min。用纯包埋剂浸泡2h，制作超薄切片，用醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色。透射电镜观察细胞形态。　　1.2.5荧光探针的配制　　处理、收集细胞，用培养液洗3次，加入呋喃3乙酰羟甲基酯AM(F1242)，羧基SNARF1/AMpH值指示剂(C1272)，线粒体绿色(M7514)荧光探针，37℃孵育30min，

8、用用培养液