红芪多糖的纯化及初步结构鉴定

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1、红芪多糖的纯化及初步结构鉴定【关键词】红芪多糖；薄层色谱；结构鉴定　　红芪（RadixHedysari）,为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根，为甘肃特产名贵药材，在临床上主要用于补气固表,利尿托毒,排脓,敛疮生肌。红芪中含有氨基酸、有机酸、β-谷甾醇、红芪多糖、微量元素等众多的生物活性物质［1］。近年来研究发现，红芪多糖的活性成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用［1，2］。特别是我们近几年的研究发现，经70%乙醇沉淀部分药理作用尤为明显。由于多糖为大分子化合物，分离纯化比较困难，而蛋白质的脱除是后期结构鉴定的关键之

2、一，为了提高多糖的得率、纯度及活性，本实验对这部分多糖进行了脱蛋白方法的研究，结合TLC、GC、IR等方法对HPS-2的结构进行了初步的分析，以期为红芪多糖的进一步研究提供理论基础。　　1材料与仪器　　红芪，购自甘肃武都；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250（西安周鼎国生物技术有限责任公司）；单糖对照品（中国药品生物制品检定所）；SephadexG-25（上海长征制药厂）；硅胶G（青岛海洋化工厂）；其它试剂均为分析纯。　　CR22GⅡ型离心机（日本日立）；UV-1700型紫外仪（日本岛津）；GC-Clarus500型气相色谱仪（美国PerkinElmer公司）；红外光谱仪（NicoletNEXU

3、S670）；BS-100A自动部分收集器、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；美国in，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。　　2.3.2三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液体积0.1倍量的三氯乙酸，低温(4℃)剧烈振摇30min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。　　2.3.3三氯乙酸-正丁醇法　　取粗多糖溶液，加入等体积的三氯乙酸-正丁醇(V/V为1∶10)试剂，振荡10min，静置分层，收集下层水溶液，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。　　2.4红芪多糖的精制将一定量的脱蛋白多糖，溶解于适量蒸馏水中。过氧化氢除色素，减压浓缩，经醇沉、离心、

4、冷冻干燥得红芪多糖1(HPS-1)，取适量的HPS-1，蒸馏水溶解后，SephadexG-25柱分离，蒸馏水洗脱，流速0.8ml/min，每3ml收集1份，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，合并主峰流出液，减压浓缩至一定体积，冷冻干燥得HPS-2。　　2.5纯度鉴定用HPLC法，TSK-gelG2500Pl/min，检测器温度35℃，样品浓度4mg/ml，进样量50μl。同时取该样品溶液在200～400nm范围内进行紫外扫描。　　2.6气相色谱参照文献［5］，多糖样品经彻底水解后制备糖腈乙酸酯衍生物，以单糖的糖腈乙酸酯衍生物为对照品进行GC分析。色谱条件:OV-101毛细管柱(50m×0.3

5、2mm)，载气为N2,流速5ml/min，分流比40∶1，FID氢火焰检测器，汽化室温度250℃，检测器温度280℃。程序升温:110℃(保持5min)→(5℃/min)→280℃(保持20min)。进样量0.4μl。　　2.7薄层色谱［6］取15mgHPS-2，三氟醋酸彻底水解，水解产物溶于1ml蒸馏水中，以标准单糖为对照，分别取样品水解液和单糖对照液在含磷酸二氢钠的硅胶G薄层板上点样，上行二次展开，展开剂:醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2(V/V)；自然风干后显色，显色剂:苯胺-邻苯二甲酸溶液，烘箱中105℃加热5～10min显色。　　2.8红外光谱测定取2mgHPS-3，KB

6、r压片，测定红外光谱。　　3.2红芪多糖分离纯化红芪多糖经SephadexG-25柱层析纯化分离的洗脱曲线（见图2）。仅出现1个洗脱峰,收集主峰,透析,浓缩，冷冻干燥,得到HPS-2。　　3.3纯度鉴定HPS-2的紫外扫描在260～280nm处吸收峰消失，茚三酮反应呈阴性，说明样品中的蛋白质基本除尽，也无核酸存在；碘-碘化钾反应呈阴性，表明样品为非淀粉多糖；经HPLC凝胶色谱后为单一对称峰。表明其为均一组分；苯酚-硫酸法测定HPS-2的糖含量为98.06%。　　3.4红芪多糖的结构分析　　3.4.1气相色谱分析　　气相色谱分析（见图3）。比较标准品和样品的保留时间,可见多糖HPS-2由鼠李糖、

7、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成。其摩尔组成比例为0.3∶0.2∶2.7∶16.1∶2.0。　　3.4.2薄层色谱分析HPS-2经薄层色谱（见图4）。检出半乳糖(Rf对=Rf样=0.40)、葡萄糖(Rf对=Rf样=0.30)、阿拉伯糖(Rf对=0.20，Rf样=0.19)、木糖(Rf对=Rf样=0.62)和鼠李糖(Rf对=Rf样=0.77)，其中木糖和鼠李糖含量较低，斑点不明显。这与气相