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1、普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定作者：曹海石添加日期：2011-08-2023:21:02浏览：270次普鲁兰多糖是由茁芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)分泌的胞外多糖[1],它具有无毒害、粘结性强和成膜性好等优良特性,可作为食品、医药方面的粘合剂和包装材料.此外,也广泛应用于水果蔬菜保鲜、种子保护、化妆品和卷烟生产等方面,是一种新型的多功能生物产品,有较好的应用前景[2,3].目前,普鲁兰多糖的应用国外已申请了多项专利,我们实验室经紫外诱变筛选出一株高产普鲁兰多糖的菌株(Aureobasidi
2、umpullulansJB518)[4],对其产生的多糖进行了分离纯化,该纯化方法简便、回收率高.同时通过薄层层析、红外光谱及核磁共振等方法对其结构进行了鉴定,证实了它的基本结构单位为麦芽三糖,每个麦芽三糖之间由A(1→6)糖苷键相连,这为该变异菌株的应用提供了理论依据.DEAE2纤维素为Whatman产品,SephadexG2100为Pharmacia产品,普鲁兰多糖(Pullulan)标准品、麦芽三糖和普鲁兰酶(EC.3.2.1.41)为Sigma产品,其它化学试剂均为国德国Bruker1FS66V真空型红外光
3、谱仪.美国Varian公司Unity400NMR仪.将本实验室经紫外诱变获得的茁芽短梗霉(JB518),在含2%蔗糖,012%的酵母浸膏,012%KH2PO4,0.1%MgSO4•7H2O,0.1%NaOH和0.04%(NH4)2SO4的液体培养基中培养,在250mL锥形瓶中加入50mL培养基,用接种环移菌3次,于28℃发酵96h,发酵液in的转速下离心30min,去沉淀,上清液加入2倍无水乙醇,搅拌、放置过夜,使普鲁兰多糖充分沉淀.沉淀液以4500r/min离心30min,得普鲁兰多糖沉淀,沉淀依次用丙酮、乙醚洗
4、涤,P1O5干燥,即得普鲁兰多糖粗品,从50mL发酵液中可得其粗品115g.1.3 多糖及蛋白质含量的测定采用改良的苯酚2硫酸法[5].取待测溶液012mL,加入浓度为50gˆL的苯酚溶液014mL,混合均匀后迅速加入2mL浓H2SO4,振荡摇匀,于室温放置30min,用721分光光度计在490nm处测定光吸收值.采用Lowry法[6],以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白质含量.1.4 核磁共振光谱测定及薄层层析1HNMR频率399195MHz,90℃脉冲25Ls,脉冲延迟时间316s,累加128次,溶剂DMSO2d
5、6,参考标准:DDMSO=2150,样品浓度5%(质量体积分数),控温误差±0.1℃.13CNMR频率100157MHz,90℃脉冲14Ls,脉冲间隔115Ls,宽带噪音去偶,累加3000次,溶剂DMSO2d6,参考标准:DDMSO=39160,样品质量体积分数12%,控温误差±0.1℃.薄层层析(TLC)采用硅胶板法[7].在10g硅胶G260干粉中加入0102molˆL的乙酸钠溶液25mL,搅拌均匀,平铺在玻璃板上,自然晾干后,于120℃加热活化30min,制成硅胶板.1.5 刚果红实验Fig.1 Curvee
6、lutedonDEAE-cellulosecolumnbywaterFig.2 CurveelutedonDEAE-cellulosecolumnbyNa2B4O7solution参照文献[8]方法.刚果红溶液浓度为215×10-5molˆL,普鲁兰多糖溶液质量浓度为10mgˆmL.将NaOH依次配成不同浓度(012～110molˆL),将普鲁兰多糖溶液和刚果红溶液混合(体积比1∶1),然后加入与混合液等体积的不同浓度的NaOH,静置15min后,用721分光光度计依次测定混合液在不同浓度的NaOH溶液中最大吸收波
7、长的变化(以刚果红溶液为对照).2 结果与讨论2.1 普鲁兰多糖的纯化2.1.1 Savage法 参照文献[9]方法.将610g普鲁兰多糖粗品稀释成115%的水溶液400mL,加入100mL氯仿ˆ丁醇混合液(体积比4∶1),充分振荡使蛋白质析出,以2000rˆmin离心30min,除去沉淀,将上清液再用此方法处理,重复7次.最后得到脱去蛋白的上清液.将该上清液逆向流水透析3d,将其减压浓缩至200mL左右,加入2倍体积无水乙醇,充分搅拌,放置过夜,使普鲁兰多糖沉淀,沉淀液以4500rˆmin离心30min,将沉淀用
8、丙酮、乙醚依次洗涤,P2O5干燥,得普鲁兰多糖粉末518g.2.1.2 DEAE2纤维素柱层析 将经Savage法除蛋白的普鲁兰多糖粉末溶于10mL蒸馏水中,进行DEAE2纤维素(硼酸型)柱层析(313cm×40cm),洗脱速度为1mLˆmin.首先用蒸馏水洗脱,分部收集(每管5mL),用改良的苯酚2硫酸法比色鉴定多糖部分,洗脱曲线如图1所示.收集多糖峰,减
