甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞转分化和tgfβ1表达的影响

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1、甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞转分化和TGFβ1表达的影响【摘要】　　目的:通过观察甲状旁腺素（PTH）对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子β1（TGFβ1）表达的影响,以探讨PTH在肾间质纤维化发病机制中的作用。方法:体外培养人近端肾小管上皮细胞（HK2）,分别用不同浓度的PTH（10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L）作用于HK2细胞48h,以及10-8mol/LPTH作用于HK2细胞不同时间（12、24、48、72h）。应用RTPCR法检测HK2细胞内αSMA、TGFβ1mRNA表达水平,免疫细胞化学法检测H

2、K2细胞表达αSMA阳性细胞百分数,A的蛋白表达水平。结果:(1)RTPCR结果表明,PTH呈剂量和时间依赖性地促进HK2细胞αSMA、TGFβ1mRNA的表达（P＜0.01）,且两者之间呈正相关（P＜0.05）。(2)免疫细胞化学结果表明,PTH可增加表达αSMA阳性的HK2细胞百分数,且呈剂量和时间依赖性（P＜0.05）。(3)A的蛋白表达量,也呈剂量和时间依赖性（P＜0.01）。结论:PTH可通过促进肾小管上皮细胞转分化以及TGFβ1的表达促进肾小管间质纤维化。【关键词】甲状旁腺素;肾小管上皮细胞;转分化;转化生长因子β1　　肾间质纤维化（re

3、nalinterstitialfibrosis,RIF）是各种肾脏疾病进展为终末期肾病的共同途径［1］。而肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化（tubularepithelialmyofibroblasttransdifferentiation,TEMT）被认为是发生RIF的重要机制之一［2］。最近报道,有些尿毒症毒素可造成RIF,如糖基化终末产物、硫酸吲哚酚、瘦素等［3-5］。甲状旁腺素（parathyroidhormone,PTH）作为尿毒症毒素之一,是否在RIF的发病机制中起着重要作用,目前尚未见报道。本实验利用体外培养的人近端肾小管上皮细胞,研究PTH对其转分化

4、以及转化生长因子β1（TGFβ1）表达的影响,以探讨PTH在RIF发病机制中的作用。　　1材料和方法　　1.1材料人近端肾小管上皮细胞（HK2细胞株）购自中国协和医科大学细胞中心（于美国ATCC公司）。PTH1-34购自Sigma公司,TRIzol购自Invitriogen公司,逆转录试剂盒购自Promega公司,α平滑肌肌动蛋白（αSMA）小鼠抗人单克隆抗体(mAb)、辣根酶标记兔抗小鼠二抗及SP法免疫组化试剂盒购自北京中杉公司,αSMA、Tubulin小鼠抗人mAb及碱磷酶标记兔抗小鼠二抗购自SantaCruze公司。DMEM/F12培养基购自Gibco

5、公司,胎牛血清（FCS）购自天津血研所。　　1.2方法　　1.2.1人近端肾小管上皮细胞的培养及药物干预HK2细胞培养于含50mL/LFCS的DMEM/F12培养液中,试验前应用无血清培养液同步化24h,分别加入终浓度为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/LPTH的含50mL/LFCS的DMEM/F12培养液刺激HK2细胞48h,以及10-8mol/LPTH刺激HK2细胞不同时间（12、24、48、72h）,收集细胞进行实验。每组实验均重复3次。　　1.2.2RTPCR法检测PTH对HK2细胞αSMA和TGFβ1mRNA表达的影响

6、细胞总RNA提取按TRIzol试剂说明书操作。应用Promega公司提供的ReverseTranscriptionSystem试剂盒进行cDNA第1链的合成,反应总体积为20μL。应用PrimerPremier5软件设计引物:αSMA(445bp):上游5′GAAGCACAGAGCAAAAGAGG3′;下游5′CAGCAGTaGTAACGAAGGAATAG3′。TGFβ1(306bp):上游5′AGGTCACCCGCGTGCTAAT3′;下游5′TCAACCACTGCCGCACAACT3′。βactin(202bp):上游5′CCTTCCTGGG

7、CATGGAGTCCTG3′;下游5′GGAGCAATGATCTTGATCTTC3′。以上引物由上海生工公司合成。扩增αSMA基因的PCR反应条件为:先于94℃变性5min,然后于94℃45s,58℃45s,72℃1min,共30个循环后,再于72℃延伸7min。扩增TGFβ1基因的PCR反应条件为:先于94℃变性5min,然后于94℃30s,58℃30s,72℃45s,共28个循环后,再于72℃延伸7min。分别取6μLPCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶在凝胶成像系统（BioRad）中扫描观察结果,分析电泳条带灰度