甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞凋亡和转分化的影响

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1、中文摘要甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞凋亡和转分化的影响摘要目的：肾间质纤维化是各种原因所致的慢性肾脏病进展为终末期肾病的共同途径。肾小管间质病变的严重程度与慢性肾脏病的进展及预后密切相关。因此，对。肾间质纤维化发生、发展的机制及其防治的研究已成为目前肾脏病领域的研究热点。作为肾小管间质结构的主要细胞之一，肾小管上皮细胞不仅是疾病进展中的受损者，而且是间质炎症、纤维化的积极参与者。研究表明，肾小管上皮细胞凋亡和转分化在肾间质纤维化的发生、发展中起着重要作用。肾小管上皮细胞凋亡导致肾小管细胞丢失、肾小管萎缩。肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化后，进入肾间质，一方面导致肾小管细胞丢失，肾小

2、管萎缩；另一方面，肌成纤维细胞分泌大量的细胞外基质和细胞因子、趋化因子，促进肾间质纤维化的进展。阻止或逆转肾小管上皮细胞的凋亡和转分化过程，可能成为防治肾间质纤维化的新途径。在慢性肾脏病早期，多数患者的血清甲状旁腺素(parathyroidhormone，PTH)水平就已显著增高。很多肾脏病学者已经认识到过度增高的PTH可看作是一种尿毒症毒素，不仅影响骨质代谢，导致肾性骨病，而且对心血管系统、神经系统、内分泌系统、免疫系统和红细胞生成等均产生负性影响，但PTH对肾脏本身的影响，尚未引起足够的重视。研究表明，某些尿毒症毒素，如晚期糖基化终末产物、甲基胍、硫酸吲哚酚、瘦素等对。肾小管间质

3、的损伤具有加剧作用，从而促进了肾间质纤维化的进展。PTH作为尿毒症毒素之一，是否影响肾小管上皮细胞凋亡和转分化过程，目前国内外少见报道。1,25(OH)2D3，又称为活性维生素D3，是调节体内钙磷代谢的重要激素。最近研究发现，它还具有调节细胞的增生、分化、凋亡、以及介导免疫反应等生物学效应。文献报道，应用1,25(OH)2D3类似物帕立骨化醇(paricalcit01)能够减轻单侧输尿管梗阻模型的肾小管间质损伤。1,25(OH)2D3能够抑制TGF．p1诱导的肾间质成纤维细胞0【。平滑肌肌动蛋白(u．smoothmuscleactin，仅一SMA)和I型胶原的表达上调，因此推测中文摘

4、要1,25(OH)2D3具有抗肾间质纤维化的潜能。但1,25(OH)2D3是否能够拮抗PTH对肾小管上皮细胞凋亡和转分化的影响，目前国内外尚未见报道。本课题利用体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HK．2细胞株)，研究PTH对其凋亡、转分化、细胞外基质的分泌和降解、以及致纤维化细胞因子转化生长因子一p1(transforminggrowthfactor-[31，TGF—D1)表达的影响，以探讨PTH在肾间质纤维化发病机制中的作用。并进一步研究1,25(OH)2D3对PTH诱导的人肾小管上皮细胞转分化和TGF．D1表达的拮抗作用，为防治肾间质纤维化提供新的思路。方法：1HK-2细胞的培养及

5、鉴定HK．2细胞株来源于美国ATCC司，细胞培养于含10％胎牛血清(fetalcalfsertlm，FCS)的DMEM／F12培养液中，37℃、5％C02条件下培养，每隔1--2天换液1次，应用O．25％胰蛋白酶一0．02％EDTA消化传代，每5～6天传代1次。用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态，免疫细胞化学法检测细胞角蛋白一18(cytokeratin．18，CK．18)、Ot．SMA的表达以进行细胞鉴定。2PTH对HK．2细胞凋亡的影响(1)药物干预：将HK．2细胞培养于含5％FCS的DMEM／F12培养液中，试验前应用无血清培养液同步化24h，分别加入终浓度为0、10。12

6、、10J1、10’10、lO一、i0罐mol／LPTH的无血清DMEM／F12培养液刺激HK．2细胞48h，或10。8mol／LPTH刺激HK．2细胞不同时间(O、12、24、48、72h)。(2)Hoechst33258染色共聚焦显微镜观察HK．2细胞核形态学的改变(3)AnnexinWPI双染流式细胞术检测HK．2细胞的凋亡百分率(4)Westernblot法检测HK．2细胞中Bax和Bcl．2的蛋白表达(5)半定量RT-PCR法检测HK．2细胞中Bax和Bcl．2的基因表达3PTH对HK．2细胞转分化和TGF．p1表达的影响(1)药物干预：将HK．2细胞培养于含5％FCS的DM

7、EM／F12培养液中，试验前应用无血清培养液同步化24h，分别加入终浓度为0、lO。2、lO。1、10。o、10一、10。8mol／LPTH的含5％FCS的DMEM／F12培养液刺激HK．2细胞48h，或10{mol／LPTH刺激HK．2细胞不同时间(0、12、24、48、72h)。中文摘要(2)倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态学改变(3)免疫细胞化学法检测HK．2细胞中0【．SMA的表达(4)Westernblot法检测细胞中0【一SMA、TGF．D