sirna沉默大鼠robo2对培养drgs神经元突起生长的影响

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1、siRNA沉默大鼠Robo2对培养DRGs神经元突起生长的影响：张海英，刘亦恒，赵久红，张显芳，劳梅丽，易西南【摘要】　　目的：观察沉默Robo2基因后对体外DRGs神经元突起生长的影响。方法：构建大鼠pSIH1H1copGFPRobo2siRNA表达质粒，使用慢病毒（lentivirus）包装系统，在293T细胞中包装含Robo2siRNA的慢病毒颗粒，然后转染DRGs神经元。实时荧光定量聚合酶链反应（RTFQPCR），realTimeSystem，Takara，Japan)。　　1.3实验方法　　1.3.1大鼠Robo2siRN

2、A表达载体的构建　　采用pSIH1H1copGFPshRNAvector，将Robo2siRNA插入此质粒中，Robo2siRNA的序列为：5′GCTGAGGGATTGTCAATAGA3′，阴性对照siRNA序列为：5′–CGATTAAGGGTCGCAAGA3′。　　1.3.2慢病毒(lentivirus)的包装生产　　慢病毒包装系统采用pPACKH1LentivectorPackagingKit（LV500A1），根据试剂盒操作指南，在293T细胞中进行包装生产含Robo2siRNA的慢病毒颗粒。　　1.3.3慢病毒滴度的测定　

3、　梯度稀释法测定病毒滴度，在荧光显微镜下计数有荧光表达的细胞数目，将得到的数值(A)除以体积再乘以相应的稀释倍数就得到了病毒原液的滴度值，即：(A÷V)×10n。　　1.3.4慢病毒转染DRG神经元　　转导前1d，取DRG神经元以2×103个细胞接种到96孔细胞培养板，转导前对细胞进行换液处理，然后按照MOI=30添加病毒液，使用含10%胎牛血清的F12完全培养基，37℃和5%CO2的条件下，将细胞接种到6孔细胞培养板，使用不含抗生素的添加10%胎牛血清的BSF2培养基，在5%CO2和37℃条件下正常培养。转导后96h，荧光显微镜下观察绿色

4、荧光蛋白的表达，计数绿色荧光阳性细胞，确定转染率。实验分3组：（1）正常细胞组（Normal）；（2）阴性对照siRNAlentivirus转染组（Control）；（3）Robo2siRNAlentivirus转染组（Robo）。　　1.3.5RTQFPCR检测Robo2siRNA—Robo2mRNA的含量　　取2μg总RNA，按RT—PCR试剂盒说明书进行操作，合成cDNA。RTPCR检测所用引物：βactin,Forer：5′AGAGGGAAATCGTGCGTGAC3′，Rerverseprimer：5′CCATACCC

5、AAGGAAGGCT3′。Robo2，Forer:5′AGTACAＡGTGCAGGGGTTGG3′，Rerverseprimer：5′AGCAAGCCATＧＧATAACTGG3′。扩增片段为326bp。　　采用下列参数进行差异PCR：94℃，50；59℃，50；72℃，1min；5个循环后加入5mmol/LGAPDH上、下游引物混合液1μL，继续进行23个循环终止。　　采用ThermalCyclerDICERealTimeSystemanalysissoftm平皿加200μL或300μL细胞裂解液，冰面上裂解20min，15000r

6、，4℃离心10min，取上清液，Bradford法进行蛋白定量(BioRadproteinassay)。以10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干电转移法转移至NC膜，室温下用封闭液封闭2h后加入一抗(Robo2)多克隆抗体，1∶250稀释；4℃孵育过夜，抗兔IgG二抗（1∶1000稀释）反应2h，化学发光法显色，X射线底片曝光。实验重复3次，GAPDH作为内参照。