利用rnai沉默kiaa0280后对缺氧诱导大鼠神经元凋亡的影响

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1、利用RNAi沉默KIAA0280后对缺氧诱导大鼠神经元凋亡的影响作者：黄海潮，潘雪刁，金桂芳，巫玮，潘琴，石磊，臧林泉【摘要】目的利用RNA干扰（RNAi）技术，观察脑缺血相关新蛋白KIAA0280被特异性沉默后对正常神经元和缺氧诱导神经元凋亡的影响。方法取新生大鼠培养至5～7d的神经元，经由密闭容器引起缺氧诱导神经元凋亡模型。采用RNAi技术封闭KIAA0280的表达，观察该基因被封闭后对正常神经元的生长以及缺氧诱导神经元凋亡的作用和影响。结果脂质体转染KIAA0280基因特异性siRNA12、24h后对正常细胞生长具有一定的影响；在此基础上缺氧4、8h，发现

2、RNAi组的神经元对缺氧诱导的神经元凋亡比对照组对缺氧更加敏感，更易受损伤。结论KIAA0280对正常神经元具有一定的作用，并且对缺氧诱导凋亡神经元具有一定的保护作用。【关键词】KIAA0280；RNAi；缺氧；神经元；凋亡　　　　Abstract:ObjectiveToobservetheeffectonnormalneuronandapoptosisneuronsinducedbyhypoxiaafterblockingtheKIAA0280byRNAitechnique.MethodsPrimaryneuronsofratsculturedfor5～7do

3、delofneuronalapoptosis.AfterblockingtheKIAA0280byRNAitechnique,theeffectsonthenormalneuronandneuronalapoptosisinducedbyhypoxiaefor12h,24h,theimpactsonthenormalneuronsbythesiRNAentfor4hand8h;itisfoundthat,paredplehypoxicgroup,theRNAigrouporesensitiveandliabletobeinjuredduringapoptosis

4、inducedbyhypoxia.ConclusionApplicationoftheRNAitosilenceKIAA0280hadcertainimpactsonthenormalneuronsandcouldpromoteapoptosisanddeathinthehypoxic-inducedneuronapoptosis.Italneurons,andplayedaroleinprotectinghypoxia-inducedapoptosisneurons.　　KeyRNA荧光差异显示技术(mRNAfluorescencedifferentialdi

5、splay)研究缺血时神经元在此应激条件下基因差异的表达，从中筛选出差异表达明显的基因（上调/下调基因），以明确防治脑缺血、缺氧相关疾病（心肌、器官移植、肿瘤等）的一个或者多个新靶点。前期工作利用MCAO造成大鼠缺血缺氧动物模型，免疫组织化学和EM高糖培养基、胰蛋白酶、优级胎牛血清（FBS）、马血清（HS）、B27、HEPEs购自美国Gibco公司。LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。EDTA由Augus公司提供。Hoechst33258、SRB由Sigma公司提供。LDH检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。siRNA由上海吉

6、玛制药技术有限公司提供。其他试剂均为国产分析纯以上产品。　　1.3仪器　　单人双面无菌操作台（苏州净化），细胞培养箱、低温高速离心机（美国Thermo），荧光显微镜（带数码相机）、倒置显微镜（德国LEica），酶标仪（美国BioRad）等。　　2方法　　2.1原代大鼠神经元的分离与培养［4］　　　　预先用多聚赖氨酸包被培养皿6h以上，吸出多聚赖氨酸，风干2h，备用。取SD大鼠乳鼠（出生1～3d），体积分数为75%的酒精消毒，断头开颅，去脑膜，取大脑皮层神经元，放进Kreb’s解剖液（保持低温），剪碎至大约0.5mm2，成沙泥状，用Kreb’s解剖液冲洗2～3次

7、，0.25％的胰酶消化10min，重复消化2～3次，将每次的消化液放入带血清的DMEM中终止消化，将细胞悬液适量吹打70～100次以分散细胞,过筛（180目），1500r/min离心5～8min，去上清，再加入DMEM培养液重悬细胞，细胞计数并调整细胞数使其到2.0～2.5×105个/mL,将其接种到预先涂以多聚赖氨酸的培养皿中。在37℃、5%CO2条件下培养,培养1d，细胞贴壁后，换液去除死细胞。在48h后，加入胶质细胞抑制阿糖胞苷，每3天换液1次，培养1个星期，可做实验。　　2.2体外细胞缺氧模型的制备［5］　　　　用培养了1个星期的细胞置密闭容器中，真空泵

8、抽空，继续保持抽取30m