二氮嗪预处理对缺氧复氧后大鼠海马神经元凋亡及jnk表达的影响

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1、二氮嗪预处理对缺氧复氧后大鼠海马神经元凋亡及JNK表达的影响作者：刘荣国，崔翔，宋娜，陈彦青【摘要】目的探讨二氮嗪(DZ)预处理能否抑制CJun氨基末端激酶(JNK)表达而减轻缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡。方法原代培养9～10d的SD大鼠海马神经元随机分为5组：对照组、DZ0，30，100μmol/L和DZ100μmol/L+5羟癸酸(5HD)100μmol/L预处理组。除对照组外，其余4组神经元自缺氧前2d开始，每天实施以上对应浓度DZ预处理1h，连续3d。于体外缺氧4h复氧48h后，采用四唑蓝比色法测定海马神经元活力，AnnexinⅤFITC流式细胞术测定凋亡率

2、，Westernblotting法检测JNK蛋白表达。结果与对照组比较，缺氧复氧后海马神经元的活力下降，凋亡率增大，JNK蛋白表达增强(P<0.05)。与其他预处理组比较，DZ100μmol/L预处理组的神经元活力高，凋亡率低(P<0.05)，其他预处理组间比较无统计学意义。DZ预处理后，JNK蛋白表达减低，且DZ100μmol/L组表达弱于DZ30μmol/L组(P<0.05)。同时给于5HD预处理后，DZ未能抑制JNK蛋白表达。结论DZ预处理可能抑制JNK表达而减轻缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡。【关键词】二氮嗪;海马;疾病模型，动物;缺氧缺血，脑;神

3、经元;细胞凋亡;JNK丝裂原活化蛋白激酶类10以二氮嗪(Diazoxide，DZ)为代表的线粒体内膜上ATP敏感钾通道(MitochondrialATPSensitivePotassiumChannel,MitoKATP)开放剂可模拟缺血预处理，激发脑的内源性保护机制而增强抗损伤效果[12]。脑损伤患者的愈后与凋亡密切相关。cJun氨基末端激酶(cJunNterminalkinase，JNK)是有丝分裂原激活蛋白激酶超家族成员之一，具有促凋亡和抗凋亡的双重功能，发挥哪一功能受到细胞类型、刺激方式、持续时间以及其他信号的影响，在离体培养大鼠海马神经元缺氧实验中，JNK信

4、号主要发挥促凋亡作用[34]。本研究以原代培养的大鼠海马神经元为实验对象，探讨DZ预处理能否抑制JNK信号蛋白表达而减低缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡，旨在进一步了解药物预处理的抗损伤机制。　　1材料与方法　　1.1主要药品、试剂和仪器二氮嗪(批号：022K1516)、5羟癸酸(5Hydroxydecanoate，5HD，批号：057H5076)购自美国Sigma公司;AnnexinⅤFITC试剂为美国BD公司产品;多克隆兔抗大鼠JNK抗体(FL型SC57)、山羊抗兔IgG抗体购自美国Santacruz公司。密闭缺氧装置为北京通达科技公司产品;电泳仪(MiniP

5、rotean3，美国AmershamBiosciences公司);酶标仪(Model550，美国BioRad公司);凝胶成像系统(GelDocXR+，美国Bio10Rad公司);流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)。　　1.2方法　　1.2.1大鼠海马神经元原代培养和鉴定取新生SD大鼠〔出生时间<24h，5～6g，二级，上海实验动物中心提供(许可证号：SCXK沪20070005)〕，经消毒、断头后分离出海马，切碎并移入0.125%胰蛋白酶溶液中消化30min。终止消化，吹打细胞悬液，以5×105mL1的细胞密度接种于直径35mm培养皿或96孔板中，

6、每皿2mL或每孔100μL，置于37℃、体积分数为0.1的CO2培养箱中培养，9～10d后行实验。神经元鉴定方法为：培养至第9天，应用神经元特异性烯醇化酶(NeuronSpecificEnolase,NSE)免疫细胞化学染色，海马神经元细胞质和突起被染成棕褐色，为阳性细胞;未被染色的细胞为阴性细胞。　　1.2.2实验分组、缺氧方法和DZ预处理方法大鼠海马神经元分为对照组(A组)、DZ0μmol/L组(B组)、DZ30μmol/L组(C组)、DZ100μmol/L组(D组)、DZ100μmol/L+5HD100μmol/L(E组)。每次实验每组采用12孔或2皿，实验重复3次。

7、除对照组外，其他组于缺氧前2d开始，每天实施以上对应浓度DZ预处理，每次1h，随后培养液全量置换，连续3d。将海马神经元置入密闭缺氧装置中后，充体积分数为0.95的N20.05的CO2气体4h，流速为0.210L/min，以造成缺氧环境，于复氧48h测定相关指标。　　1.2.3四唑蓝比色法测定神经元活力96孔板之每孔中加入5mg/mL四甲基偶氮唑蓝磷酸缓冲液10μL，继续培养4h后弃去上清液，再加入100μL二甲基亚砜均匀振荡10min，在酶标仪(测量波长600nm)上读取数值为吸光度值，以吸光度值表