sirna沉默大鼠robo2对培养drgs神经元突起生长的影响

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1、siRNA沉默大鼠Robo2对培养DRGs神经元突起生长的影响作者：张海英，刘亦恒，赵久红，张显芳，劳梅丽，易西南【摘要】　　目的：观察沉默Robo2基因后对体外DRGs神经元突起生长的影响。方法：构建大鼠pSIH1H1copGFPRobo2siRNA表达质粒，使用慢病毒（lentivirus）包装系统，在293T细胞中包装含Robo2siRNA的慢病毒颗粒，然后转染DRGs神经元。实时荧光定量聚合酶链反应（RTFQPCR），Westernblot检测Robo2mRNA和蛋白的表达，显微镜下观察DRGs神

2、经元突起生长情况。结果：RTFQPCR检测DRGs神经元中Robo2mRNA的表达量，Robo组明显低于正常组，具有显著性差异（P<0.01）。Westernblot检测DRGs神经元中Robo2蛋白的表达量，Robo组明显低于正常组，具有显著性差异（P<0.01）。Robo2siRNA转入DRGs神经元的转导率为93.01%，与正常组比较，Robo2siRNAlentivirus转导细胞（Robo）组轴突生长明显受到抑制。结论：Robo2蛋白是DRGs神经元轴突生长的重要导向分子，可促进轴突的生长

3、。【关键词】DRG；Robo2；基因沉默；大鼠　　［ABSTRACT］Objective:ToobservethesilencingRobo2ongrowthofDRGsneuronalneurite.Method:RattusRobo2siRNAwas12synthesizedandclonedintopSIH1H1copGFPplasmid.pSIH1H1copGFPRobo2siRNAlentiviruswasgeneratedin293TcellsbypPACKH1TMLentivectorPac

4、kagingKitandtransductedintoDRGneurons.Then，theRobo2weretestedbyRTFQPCRandWesternblot.Results:TheexpressionofRobo2mRNAandRobo2proteininRobo2siRNAlentivirusgroupwerelowerthanthenormalgroup.ThetransductionrateofRobo2siRNAwas93.01%bylentivirusvector.Robo2siRNAl

5、entivirusgroupcanefficientlysuppressneuritegrowthcomparedwithnormalgroup.Conclusions:Robo2canpromotethegrowthofneuriteofDRG.　　［KEYWORDS］DRG;Robo2；Genesilencing；Rat　　　Roundabout（Robo）是一类与发育有关的保守跨膜受体家族，参与胚胎中枢神经轴突导向，促进树突分支、轴突生长，介导细胞迁移［1，2］。我们已报道成年大鼠背根神经节（dorsalro

6、otganglion，DRG）表达Robo及Slit，且周围神经损伤能改变DRG内Robo的表达，其中Robo1和Robo2表达增高［3］。Robo2是否参与了再生周围神经突起生长和导向？值得深入研究。本研究拟通过慢病毒载体，把针对Robo2基因的小干扰RNA（smallinterferenceRNA,siRNA）体外转染DRG神经元，观察对DRG神经元Robo2表达及突起生长的改变。12　　1材料与方法　　1.1细胞培养　　大鼠DRG神经元的分离培养：SD大鼠由湖南农业大学实验动物中心提供。无菌条件下取新生1周龄

7、SD大鼠背根节，F12冲洗组织数次后，于解剖显微镜下剥离被膜，置0.125%和0.25%胶原酶内各消化30min，接着移入0.25%胰酶继续消化15min，终止消化，在BSF2（含F12、1%N2和0.3%BSA）中吹打组织，900r/min离心5min，去上清，细胞重悬于含1mLBSF2的离心管内，在离心管底部添加2mL15%BSA，900r/min离心10min，去上清，BSF2重悬细胞，置24孔板于CO2培养箱中培养。48h后视细胞贴壁情况更换培养液。　　1.2试剂　　pSIH1H1copGFPshRNA

8、vector（SystemBiosciences,US）、pPACKH1LentivectorPackagingKit（SystemBiosciences,US，LV500A1）、Trizol试剂(Invitrogen,USA)、RTPCR试剂盒(Takata，Japan)、OligodT（D511）、ThermalCyclerDicerTMrealTi