重组人神经肽y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究

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1、重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究作者：丁克祥董萍郑永晨杨永鹏朱晓亮韩晋云单志新丁宇丁振华【摘要】目的在大肠杆菌中表达人神经肽Y，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aNPY转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethodsTherebinantplasmidpET28aNPYedatography.ThenbioinformaticanalysisoftheNPYproteinidpET28aNPYexpre

2、ssedrebinanthumanNPYprotein.HighlypurifiedNPYfusionproteinatography.RelatedbiologicalcharacteristicsofNPYidpET28aNPYcanbesuccessfullyexpressedinDE3.HighlypurifiedproteinscanbeobtainedbyNi2+NTAaffinitychromatography.NPY′sbiologicalcharacteristicsarepredicted,ent.　　【Ke

3、yatics　人神经肽Y(Neuropeptide,NPY)是一个由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢和外周神经系统。此外,NPY也存在于其他组织、器官及腺体中。NPY影响摄食行为、激素分泌、心血管功能、调节体温、生物节律、性行为及情绪等各种生物功能,故越来越受到人们的重视。NPY释放后主要通过NPY受体起作用，不同受体起不同的作用,各组织所含受体种类及分布密度也不相同〔1，2〕。近来研究表明NPY可在局部作用于内皮细胞及脂肪细胞上Y2受体，促进局部脂肪组织生长。而且在NPY的作用下，局部脂肪移植物可存活更长时间不被机体吸收〔3

4、，4〕。据此，理论上不仅可通过局部增加NPY的量，使更多的NPY作用于Y2受体促进该部位脂肪组织的增加;还可通过局部注入NPY抗体，使其中和游离的NPY蛋白，减少NPY与Y2受体的结合而达到该部位脂肪组织减少的效果。即以NPY为靶标，促进脂肪组织的转移。为此,本研究用基因克隆技术在大肠杆菌中制备NPY的融合蛋白,一方面获得高纯度的NPY蛋白，另一方面所得的蛋白制备NPY抗体,以便用于脂肪转移和肥胖代谢综合征的临床前研究。　　1材料与方法　　1.1材料E.coliBL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aNPY的保存菌均

5、由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1重组人NPY融合蛋白的诱导表达用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aNPY的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5

6、mlLB(Kan+)液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日取培养过夜菌液500μl再接种于50ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养4h。取加IPTG前和后的菌液各1ml，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50μl，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心10min，每个样品取20μl上样于15%的SDSPAGE胶上电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2

7、h，然后脱色，拍照记录结果。　　1.2.2包涵体的释放据上所述，在2000ml的摇瓶中装500ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃以5000r/min离心15min，收集菌体沉淀;加入25mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃12000r/min离心30min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃12000r/min离心细菌冻融液30min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25ml，吹打混匀;置冰上对

8、细菌冻融液进行超声处理，10min/次，处理时间30min;超声处理后，于4℃12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。　　1.2.3包涵体的提纯菌细胞裂解沉淀物中加入含4mol/L尿素的包涵体提纯液25m