重组人神经肽y受体y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

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1、重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究作者：丁克祥董萍郑永晨杨永鹏朱晓亮韩晋云单志新丁宇丁振华【摘要】目的在大肠杆菌中表达人神经肽YY2受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aY2转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethodsTherebinantplasmidpET28aY2edatography.ThenbioinformaticanalysisoftheY2receptoridpET28aY2expressedrebinanthum

2、anY2receptorprotein.Highlypurifiedfusionproteinatography.RelatedbiologicalcharacteristicsofY2receptoridpET28aY2canbesuccessfullyexpressedinDE3.HighlypurifiedproteinscanbeobtainedbyNi2+NTAaffinitychromatography.Y2receptor′sbiologicalcharacteristicsarepredicted,ent.　　【Keyatics　　神经肽Y(NPY)是由

3、36个氨基酸组成的多肽,属于胰多肽家族,作为一个信号分子在不同物种间有高度的保守性。人体内NPY相关的受体主要存在于中枢神经组织中,此外在外周组织也有分布。其中与脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2和Y5〔1，2〕。NPY通过与其受体Y2(NPY2R)的作用刺激内皮细胞增殖分化,在血管生成过程中重要的作用〔3，4〕，Kuo等〔1〕的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合征形成中有重要的作用。他们认为,NPY与NPY2R相互作用,通过血管生成引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作为媒介用以增加移植脂肪组织的体积和存活。　　1材料与方

4、法　　1.1材料E.coliBL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1重组人NPY2R融合蛋白的诱导表达用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+

5、)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5mlLB(Kan+)液体培养基，37℃振摇培养过夜。次日取培养过夜菌液500μl再接种于50ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养4h。取加IPTG前和后的菌液各1ml，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50μl，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心10min，每个样品取20μl上样于10%的SDSPAGE凝胶电泳，电泳结束后取考马斯亮

6、兰R250染色2h，然后脱色，拍照记录结果。　　1.2.2包涵体的释放据上所述，在2000ml的摇瓶中装500ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃，5000r/min，离心15min，收集菌体沉淀;加入25mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃，12000r/min，离心30min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃，12000r/min，离心细菌冻融液30min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超

7、声处理，10min/次，处理时间30min;超声处理后，于4℃，12000r/min，离心30min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。　　1.2.3包涵体的提纯于菌细胞裂解沉淀物中加入含4mol/L尿素的包涵体提纯液25ml,吹打混匀，室温静置30min,12000r/min离心30min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。　　1.2.4包涵体的裂解于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25ml，吹打混匀，室温静置6h，使包涵体充分裂解,2000r/min离心30min，收集上清液，即为包涵体裂解物。　　1.2.5变性蛋白