重组人神经肽y受体y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文

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1、重组人神经肽Y受体Y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文丁克祥董萍郑永晨杨永鹏朱晓亮韩晋云单志新丁宇丁振华【摘要】目的在大肠杆菌中表达人神经肽YY1受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aY1转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethodsTherebinantplasmidpET28aY1edatography.ThenbioinformaticanalysisoftheY1recep

2、toridpET28aY1expressedrebinanthumanY1receptorprotein.Highlypurifiedfusionproteinatography.RelatedbiologicalcharacteristicsofY1receptoridpET28aY1canbesuccessfullyexpressedinDE3.HighlypurifiedproteinscanbeobtainedbyNi2+NTAaffinitychromatography.Y1recepto

3、r′sbiologicalcharacteristicsarepredicted,ent.【Keyatics神经肽Y(Neuropeptide,NPY)是一种内源性的促食欲因子，NPY主要通过与相应受体结合起作用。其受体(Receptor)主要有Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6受体亚型,属于G蛋白偶联的受体家族。这些受体亚型介导信息传导均与G蛋白偶联有关,均能抑制腺苷酸环化酶的生物合成,最终动员或抑制钙离子释放。不同受体起不同的作用,各组织所含受体种类及分布密度也不相同〔1～4〕。NPYY1、Y2和Y5

4、受体(NPY1R,NPY2R,NPY5R)被认为与NPY诱导摄食和引起肥胖的作用机制有关。实验表明,在NPY1R缺失小鼠中NPY诱导的摄食效应明显减弱〔5〕;肥胖大鼠口服NPY1R抑制剂能够抵抗肥胖〔6〕;NPY1R抑制剂脑室注射能减少大鼠或小鼠的摄食〔7，8〕。这充分说明,NPY1R在大鼠和小鼠的食物摄取和体重调控中起着重要作用。1材料与方法1.1材料E.coliBL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY1的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×H

5、is抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1重组人NPY1R融合蛋白的诱导表达用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY1的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5mlLB(Kan+)液体培养基，37℃振摇培养过夜

6、。次日取培养过夜菌液500μl再接种于50ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养4h。取加IPTG前和后的菌液各1ml，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50μl，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心10min，每个样品取20μl上样于10%的SDSPAGE胶上电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2h，然后脱色，拍照记录

7、结果。1.2.2包涵体的释放据上所述，在2000ml的摇瓶中装500ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃，5000r/min，离心15min，收集菌体沉淀;加入25mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃12000r/min离心30min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃12000r/min离心细菌冻融液30min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25ml，吹打混匀;置冰

8、上对细菌冻融液进行超声处理，10min/次，处理时间30min;超声处理后，于4℃12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。1.2.3包涵体的提纯于菌细胞裂解沉淀物中加入含4mol/L尿素的包涵体提纯液25ml,.freelin,12000r/min离心30min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。1.2.4包涵体的裂解于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25ml，吹打混匀，室温静置6h，使包涵体充分裂解,