应用组织芯片研究claudin4在胃腺癌中的表达及临床意义

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1、应用组织芯片研究Claudin4在胃腺癌中的表达及临床意义作者：张真真张声郑珂陈虹王行富陈余【摘要】　　目的探讨紧密连接蛋白Claudin4的表达与胃腺癌侵袭转移及预后的相关性。方法应用组织芯片免疫组织化学染色方法检测胃腺癌不同区域(黏膜层非肿瘤性胃腺上皮，黏膜层胃癌组织，肿瘤中心区胃癌组织，侵袭前沿区胃癌组织及淋巴结转移灶胃癌组织)Claudin4的表达情况。结果黏膜层非肿瘤区发生肠上皮化生的胃腺上皮Claudin4高表达，而正常胃腺上皮低表达(P<0.001);在癌组织中，从黏膜层、肿瘤中心区、侵袭前沿区到淋巴结转移灶中胃癌组织Claudin4表达呈现先上升后下降的抛物线式

2、表达的趋势，肿瘤中心区胃癌组织Claudin4表达最高，淋巴结转移灶胃癌组织Claudin4表达最弱(P<0.05)。对肿瘤中心区胃癌组织Claudin4表达的分析发现，Claudin4的表达与胃腺癌Lauren分型有关，肠型胃癌Claudin4的表达高于弥漫型胃癌(P<0.05)，而与胃腺癌的浸润程度呈负相关关系(P<0.05﹚。Claudin4在胃腺癌的表达与患者的术后生存率没有明显关系。结论Claudin4的表达与胃腺癌的侵袭转移有一定的关系，可能参与胃腺癌侵袭转移过程中上皮与间叶表型的转化。【关键词】连接蛋白类胃肿瘤芯片分析技术免疫组织化学　　胃癌是我国

3、的常见病和多发病，每年胃癌新发病例及死亡率分别占全部恶性肿瘤的17%和20%以上，仅次于肺癌[1]。胃癌患者的预后与肿瘤的侵袭转移密切相关。胃癌侵袭转移的重要机制之一是细胞间接触抑制的丢失，细胞粘附性降低。细胞间的连接受连接复合体(包括紧密连接、粘附连接、桥粒等)调节，Claudins是构成紧密连接的骨架蛋白，参与维持细胞极性、屏障及信号传导功能。近年发现Claudins在各种上皮源性肿瘤中表达异常，可能参与肿瘤的发生发展，但Claudins表达与胃腺癌侵袭转移及预后间的关系尚未完全阐明。Claudin4是Claudins家族成员之一，是产气荚膜梭菌肠毒素﹙CPE﹚碳末端的受体，是肿瘤靶向治

4、疗的研究热点。笔者应用组织芯片免疫组织化学染色，检测Claudin4在胃腺癌组织中的表达，探讨其与胃腺癌侵袭转移及预后的关系。　　1材料及方法　　1.1材料2000-2006年福建医科大学附属第一医院胃癌手术切除、有完整随访资料的存档蜡块109例。男性79例，女性30例，年龄中位数61岁(23～84岁)。病理诊断按照2003年分期：Ⅱ期12例，Ⅲ期75例，Ⅳ期22例。均为死亡病例，随访时间1～76月，中位生存时间12月。　　1.2组织芯片制备根据HE切片在供体组织蜡块上选取目标区域并标记：黏膜层癌旁胃黏膜(正常胃黏膜上皮66例，肠化生上皮43例)，黏膜层胃癌组织，肿瘤中心区胃癌组织(即黏膜

5、层与侵袭前沿中间的胃癌组织)、侵袭前沿区胃癌组织(即肿瘤纵向侵袭胃壁最远处)及淋巴结转移灶胃癌组织[2];将相应组织由供体蜡块转移至受体蜡块的阵列孔中，每个孔芯的直径2mm，每个蜡块含有31个点，其中一个为标志点。　　1.3免疫组织化学染色免抗人Claudin4多克隆抗体(浓缩型，1∶400稀释，德国ThermoScientific公司);二抗(羊抗兔试剂盒，SP法，美国Labvision公司)。操作步骤如下：组织芯片蜡块4μm连续切片，60℃烤片14h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后水化，高压热修复(柠檬酸pH6.0，2min)，自然冷却，过氧化物酶阻断10min，非免疫动物血清室温孵育10

6、min，一抗室温孵育3h，二抗孵育10min，DAB显色镜下控制，每个步骤之间PBS冲洗3次，每次2min。苏木素复染。以PBS代替一抗作阴性对照。　　1.4判读标准Clauidn4染色定位于胃腺癌细胞及癌旁胃腺上皮细胞膜和胞质，根据阳性染色细胞着色的程度判别结果：“-”为阴性;“+”呈棕黄色颗粒状;“”呈棕褐色颗粒状(图1)。两位病理科医师在双盲的情况下进行判读，如果判读结果不一致，则重新评估直到达成一致为止。　　1.5统计学处理运用SPSS10.0软件进行统计学分析，用MannEier法进行单因素生存分析。　　A：正常胃黏膜上皮;B：肠化胃黏膜上皮;C：胃腺癌与正常胃黏膜移行处;D：

7、肿瘤中心癌组织;E：侵袭前沿癌组织;F：淋巴结转移灶.　　图1Claudin4在胃腺癌不同部位及癌旁胃黏膜呈异质性表达(SP法×400)　　Fig1Claudin4heterogeneousexpressionindifferentareasofgastricadenocarcinomasandadjacentnoneoplasticgastricepithelium(SP×400)　　2