小鼠肝kupffer细胞分离方法探讨

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1、小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨作者：严茂林王耀东田毅峰赖智德周松强邱福南【摘要】　　目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。结果3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94

2、.5±1.9)％。结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。【关键词】肝；枯否细胞；离心法,梯密度；小鼠，近交BABLc；细胞分离　　肝Kupffer细胞（Kupffercell,KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。如何获得较多数量和较高纯度的KC

3、是研究其在机体中作用机制的首要条件。而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。试验前禁食12h，自由饮水，随机分为3组。　　1.1.2主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES（美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAK

4、O公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI1640培养基（美国Gibco公司）。超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（日本Nikon公司），低温高速离心机（美国Beckman公司）。　　1.1.3主要液体的配制（1）前灌注液（Hank's平衡盐溶液）。KCl5mmol/L,KH2PO41mmol/L,NaCl115mmol/L,HEPES25mmol/L。调整pH值为7.4。（2）后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hank's平衡盐溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20％链霉蛋白酶2mL；酶消化液：含0.20％链

5、霉蛋白酶2mL、0.012％DNAaseⅠ2mL；方法2中的后灌注液含0.025％Ⅳ型胶原酶2mL。酶消化液：含0.05％IV型胶原酶2mL；方法3中的后灌注液含0.05％Ⅳ型胶原酶1mL、0.4％链霉蛋白酶1mL；酶消化液：含0.10％Ⅳ型胶原酶1mL、0.40％链霉蛋白酶1mL、0.012％DNAaseⅠ2mL；　　1.1.4SPS液的配制100％Percoll液和8.5%NS以9∶1的比例混合，配制成SPS原液；以70％Percoll液2mL配制：SPS1.4mL和PBS0.6mL混合配制所得；30％Percoll液的配制：PBS1.4

6、mL和SPS0.6mL混合配制所得。　　1.1.5RPMI1640完全培养基的配制按说明书配制，0.22μm滤器过滤除菌，临用前加入10％新鲜灭活的小牛血清，青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL。　　1.2BABL/c小鼠KC分离方法　　1.2.1原位肝脏灌注步骤参考　　2结果　　2.1荧光显微镜观察在328nm荧光激发下，未见KC发出荧光。　　2.2KC的形态变化新鲜分离的KC呈圆形，细胞核大，细胞质少，折光性较强，远小于肝细胞，接种1h后少部分细胞已贴壁；培养24h后，多数细胞已伸展；培养48h后，绝大多数细胞已贴壁，且充分伸展

7、，可见星形或不规则形；方法3所得KC培养24h后的细胞贴壁及形态情况（图1A）。　　KC:肝Kupffer细胞.A：KC培养24h后的形态（×10）；B：KC培养6h后吞噬试验（×10）；C：KC培养48h后免疫组织化学图像（×20）.　　图1KC培养24h后的形态、6h后的吞噬试验、48h后的免疫组织化学表现（略）　　Fig1MorphousofKCafter24hoursculture,thephagocytosistestofKCafter6hoursculture,immunohistochemistryofKCafter48hour

8、sculture　　2.33种方法分离的KC活力、得率及纯度情况（表1）。　　表13种分离方法细胞得率及细胞纯度的比较（略）　　Tab1parisontheyiel