小鼠肝kupffer细胞分离方法探讨

《小鼠肝kupffer细胞分离方法探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨作者：严茂林王耀东田毅峰赖智德周松强邱福南【摘要】　　目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。结果3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。结论联合链霉蛋白酶

2、和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。【关键词】肝；枯否细胞；离心法,梯密度；小鼠，近交BABLc；细胞分离　　肝Kupffer细胞（Kupffer10cell,KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。而传统的分离方法往往因数量和纯度

3、不足而影响实验结果。本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。试验前禁食12h，自由饮水，随机分为3组。　　1.1.2主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES（美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI1640培养基（美国Gibco公司）。超净工作台

4、（苏州净化设备厂），倒置显微镜（日本Nikon公司），低温高速离心机（美国Beckman公司）。　　1.1.3主要液体的配制（1）前灌注液（Hank's平衡盐溶液）。KCl5mmol/L,KH2PO41mmol/L,NaCl115mmol/L,HEPES2510mmol/L。调整pH值为7.4。（2）后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hank's平衡盐溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20％链霉蛋白酶2mL；酶消化液：含0.20％链霉蛋白酶2mL、0.012％DNAaseⅠ2mL；方法2中的后灌注液含0.025％Ⅳ型胶原酶2mL。酶消化液：含0.05％IV型胶原酶2

5、mL；方法3中的后灌注液含0.05％Ⅳ型胶原酶1mL、0.4％链霉蛋白酶1mL；酶消化液：含0.10％Ⅳ型胶原酶1mL、0.40％链霉蛋白酶1mL、0.012％DNAaseⅠ2mL；　　1.1.4SPS液的配制100％Percoll液和8.5%NS以9∶1的比例混合，配制成SPS原液；以70％Percoll液2mL配制：SPS1.4mL和PBS0.6mL混合配制所得；30％Percoll液的配制：PBS1.4mL和SPS0.6mL混合配制所得。　　1.1.5RPMI1640完全培养基的配制按说明书配制，0.22μm滤器过滤除菌，临用前加入10％新鲜灭活的小牛血清，青霉素100

6、U/mL,链霉素100μg/mL。　　1.2BABL/c小鼠KC分离方法　　1.2.1原位肝脏灌注步骤参考文献[3]。　　1.2.2肝脏非实质细胞的提取及离心将上述肝细胞滤液4℃离心（800r/min×8min），取沉淀。加入PBS4mL，4℃离心（80r/min×3min），除去沉淀，取上清。加入PBS4mL充分混匀，再次以4℃10离心（150r/min×8min），取沉淀。沉淀加入PBS2mL,充分混匀。取10mL离心管1支，依次加入70％Percoll、30％Percoll、细胞悬液各2mL及少许PBS，4℃离心（1600r/min×22min）。离心管自上而下依次为：细

7、胞碎片、30％Percoll层、30％Percoll层与70％Percoll层之间的是大量KC及少量肝窦内皮细胞、70％Percoll层、离心管底层为少许红细胞。取30％Percoll和70％Percoll层之间的白色物，PBS8mL稀释细胞，4℃离心1次（600r/min×8min），4℃分别离心（150r/min×8min）2次，除去上清。　　1.2.3KC贴壁培养将上述细胞沉淀用适量10％胎牛RPMI1640稀释，取10μL用台盼蓝染色检测细胞活性及细胞计数，分别计算3种方法的KC得率