Kupffer细胞分离培养

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1、肝脏巨噬细胞(KCs)的分离与培养研究生：魏思东戴卓娅导师：龚建平2010-05-04肝脏细胞悬液制备门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS，直至肝脏呈黄白色，总量约20ml。再用20ml0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma，PBS液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。取下肝脏加入20ml0.05％胶原酶，37oC孵育40min，经200目细胞筛过滤。PBS稀释至50ml,300×g5min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀释至50ml，用50g×g3min,4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g，5min,4oC离心，取沉淀。用镊子划碎肝组织装入试管

2、消化肝脏消化吹打后细胞悬液细胞悬液过滤洗涤与肝细胞沉淀梯度离心Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。取4支无菌离心管，沿着管壁加入2mL50％的SIP，然后倾斜（60o）试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4管）。500×g，离心15min，4oC，50％的SIP和25％的SIP层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍，弃上清(300×g，5min)。非肝细胞SIP离心准备SIP离心后细胞层与洗涤细胞贴壁把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。取出培养板，用37℃的PBS

3、液轻轻冲洗3次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。刚分离出的细胞KCs的培养方法培养5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清（HyClone）。2天及3天KCs2周及3周KCsKCs的鉴定活力判定通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的24孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，2h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠），CD163免疫组化鉴定KCs（大鼠）,阳性为KCs。KCs吞墨图像与

4、台盼蓝拒然图片F4/80的免疫荧光和CD163免疫细胞化学(x400)致谢感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋，陈琦，等同学。感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。