重组人红细胞生成素治疗脊髓冲击性损伤的实验研究

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1、重组人红细胞生成素治疗脊髓冲击性损伤的实验研究作者：王波，姜伟，刘海鹰，陈定宝,郑姝颖【摘要】［目的］研究重组人红细胞生成素(rebinanthumanerythropoietin，rhEPO)对脊髓冲击性损伤的治疗效果。［方法］24只新西兰白兔采用重物坠落的方法造成脊髓冲击性损伤。损伤12h后，对照组静脉给予生理盐水；小剂量组、中等剂量组和大剂量组分别静脉给予rhEPO100、500、1000IU／kg。损伤后24h、48h、1周评估下肢神经功能。损伤后1周时处死动物，脊髓标本进行HE和Caspase3组化染色，电子显微镜评估超微结构损伤。［结果］EPO治疗组

2、的神经功能评分明显高于对照组，HE染色和电子显微镜显示组织和超微结构损伤明显轻于对照组，Caspase3阳性细胞数明显少于对照组。中等剂量组和大剂量组的治疗效果无显著性差异。［结论］脊髓冲击性损伤后12h给予人红细胞生成素可减轻脊髓的组织和超微结构继发性损伤，并可对抗神经细胞凋亡，促进脊髓功能恢复。中等剂量EPO是治疗脊髓损伤的适当选择。【关键词】重组人红细胞生成素；脊髓损伤；凋亡；超微结构　　脊髓损伤从受伤至经检查明确诊断及开始治疗，一般需数小时甚至更长时间。除手术解除脊髓压迫外，大剂量甲基强的松龙冲击是被广泛应用的药物治疗方法，但功能恢复令人失望，同时大剂量甲基

3、强的松龙的副作用也不能忽视［1］，探索脊髓损伤新的药物治疗方法是迫切需要解决的问题。已证实红细胞生成素是一种具有神经营养和保护作用的细胞因子，脊髓损伤后即刻给予EPO可减轻脊髓损伤程度［2］，但脊髓损伤后数小时或更长时间后给予EPO的治疗效果及EPO的剂量-效应关系分析尚未见　　本实验显示脊髓急性机械损伤后12h给予rhEPO，下肢神经功能随时间逐步改善，损伤后1周时的HE染色及电子显微镜均可见EPO治疗组的脊髓损伤程度均轻于对照组，表明EPO可促进神经功能恢复，对抗脊髓的继发性损伤。可能的机制有EPO可抑制兴奋性氨基酸引起的细胞毒性及调节脊髓损伤后的血管形成，减轻

4、血管痉挛，增加损伤部位的血供，从而减小损伤面积和程度［8］。其他可能机制还有EPO可减低细胞内钙离子浓度、NO产物、抗炎作用等［9、10］。　　图1矩形框示Caspase3阳性细胞计数的脊髓区域选择方法（略）　　图2脊髓损伤后各组不同时间的下肢神经功能评分（略）　　图3脊髓损伤后1周时，各组的Caspase3阳性细胞计数（略）　　图4Caspase3免疫组化染色（略）　　4a.对照组，可见多数神经元(黑色箭头)和胶质细胞(白色箭头)的细胞核染色成茶色。可见明显空泡和囊性变(*)4b.小剂量EPO组，可见多数细胞核染成茶色(黑色箭头)，部分神经元及胶质细胞核未染成

5、茶色(白色箭头)4c.中等剂量EPO组，可见大多数细胞核维持正常蓝色，部分神经元和胶质细胞核染成茶色(黑色箭头)4d.大剂量EPO组，可见绝大多数神经元和胶质细胞核为蓝色，散在茶色细胞核(黑色箭头)　　图5脊髓损伤后1周时，各组超微结构损伤评分（略）　　图6脊髓损伤后1周时，各组超微结构的电子显微镜表现（略）　　6a.对照组，轴索变性，髓鞘呈蜂巢样变，与轴索分离，线粒体结构破坏消失，细胞核浓缩6b.小剂量EPO治疗组，轴索水肿变性，髓鞘空泡样变，可见轻度脱髓鞘改变，线粒体变性，但结构仍存在，细胞核轻度损伤6c、d.中等剂量和大剂量EPO组，轴索、髓鞘损伤明显减轻，线粒

6、体，细胞核基本正常(m,线粒体；A.轴索；M.髓鞘；N.细胞核；*.脱髓鞘改变)　　Caspase3是一种半胱氨酸蛋白水解酶，是引起细胞凋亡的最后通路。脊髓损伤后，线粒体破裂后释放出细胞色素c，可激活Caspase3，引起染色质浓缩、核小体裂开。既往常采用TUNEL染色反映细胞的凋亡情况，但假阳性率较高，而Caspase3染色特异性较好，假阳性率低。本研究显示脊髓损伤后给予EPO治疗，可显著减少Caspase3染色的阳性细胞数，提示EPO具有对抗细胞凋亡的作用，防止凋亡引起的组织破坏，保留部分脊髓功能。虽然凋亡被认为是一个非炎症性细胞死亡，不涉及细胞膜破裂和细

7、胞内容物泄漏，但细胞凋亡后可继发产生炎性反应。EPO是具有抗炎作用的一种细胞因子，可减轻炎症引起的脊髓损伤。脊髓急性冲击损伤后，运动神经元及少突胶质细胞经历凋亡过程持续数日至2周左右，药物干预的时间比较从容。　　本实验表明，脊髓损伤后12h，rhEPO治疗可减轻脊髓损伤后继发性损伤，减轻髓鞘断裂、脱髓鞘损伤及细胞核、线粒体和轴索变性等。静脉单次给予500IU／kgEPO可有效地保护神经元超微结构，给予1000IU／kg超微结构评分略高于EPO500IU／kg治疗组，但未达到统计学差异。治疗脊髓损伤使用的EPO剂量远高于治疗贫血性疾病的剂量，大剂量E