重组人红细胞生成素治疗脊髓冲击性损伤的实验研究.doc

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1、重组人红细胞生成素治疗脊髓冲击性损伤的实验研究作者：王波，姜伟，刘海鹰，陈定宝,郑姝颖【摘要】［目的］研究重组人红细胞生成素(recombinanthumanerythropoietin，rhEPO)对脊髓冲击性损伤的治疗效果。［方法］24只新西兰白兔采用重物坠落的方法造成脊髓冲击性损伤。损伤12h后，对照组静脉给予生理盐水；小剂量组、中等剂量组和大剂量组分别静脉给予rhEPO100、500、1000IU／kg。损伤后24h、48h、1周评估下肢神经功能。损伤后1周时处死动物，脊髓标本进行HE和Caspase3组化染色，电子显微镜评估超微结构损伤。［结果］EPO治疗组

2、的神经功能评分明显高于对照组，HE染色和电子显微镜显示组织和超微结构损伤明显轻于对照组，Caspase3阳性细胞数明显少于对照组。中等剂量组和大剂量组的治疗效果无显著性差异。［结论］脊髓冲击性损伤后12h给予人红细胞生成素可减轻脊髓的组织和超微结构继发性损伤，并可对抗神经细胞凋亡，促进脊髓功能恢复。中等剂量EPO是治疗脊髓损伤的适当选择。【关键词】重组人红细胞生成素；脊髓损伤；凋亡；超微结构　　脊髓损伤从受伤至经检查明确诊断及开始治疗，一般需数小时甚至更长时间。除手术解除脊髓压迫外，大剂量甲基强的松龙冲击是被广泛应用的药物治疗方法，但功能恢复令人失望，同时大剂量甲基强的松

3、龙的副作用也不能忽视［1］，探索脊髓损伤新的药物治疗方法是迫切需要解决的问题。已证实红细胞生成素是一种具有神经营养和保护作用的细胞因子，脊髓损伤后即刻给予EPO可减轻脊髓损伤程度［2］，但脊髓损伤后数小时或更长时间后给予EPO的治疗效果及EPO的剂量-效应关系分析尚未见文献报道。本研究观察兔脊髓损伤后12h给予不同剂量重组人红细胞生成素(rhEPO)的治疗效果。　　1材料和方法　　1.1脊髓损伤方法　　速眠欣(0.2ml／kg)肌肉注射麻醉，俯卧于实验台上。胸背部正中切开，显露棘突及椎板。切除T8棘突及全椎板，显露硬膜囊。以20g圆柱状(直径3　mm)重物通过导向套管，于

4、脊髓上方4cm垂直落下(80g／cm)，造成脊髓冲击损伤。关闭切口，12h后静脉给予不同药物治疗。每日行人工挤压排尿3次，直至可自主排尿。　　1.2实验设计6　　新西兰白兔24只，8～12个月龄，体重2.2～3.2kg，置于室温、湿度控制的房间内单笼分别饲养。随机分为4组，每组6只。(1)对照组(Control)，脊髓损伤12h后静脉注射生理盐水2ml;(2)小剂量EPO组(E100)，脊髓损伤12h后静脉rhEPO(济脉欣，华北制药金坦科技有限公司，下同)100IU／kg;(3)中等剂量EPO组(E500)，脊髓损伤后12h后静脉给予rhEPO500IU／kg;(4)

5、大剂量EPO组(E1000)，脊髓损伤12h后静脉给予rh-EPO1000IU／kg。　　麻醉觉醒后及脊髓损伤后24h、48h、1周采用Drummond，J．C.&Moore标准［3］评价下肢运动机能。　　　　1.3HE和Caspase3染色及电子显微镜观察　　7d后大剂量速眠欣(0.5ml／kg)麻醉试验动物，再次显露并完整取出脊髓损伤节段，长约10mm。以损伤中心为界，将脊髓横切分成两半，一半脊髓标本进行HE染色和Caspase3染色。另一半行电子显微镜检查，观察超微结构损伤情况。　　1.3.1HE染色10％福尔马林固定72h，石蜡包埋，制作5μm的组织切片

6、，常规HE染色，光镜下观察。　　1.3.2Caspase3免疫染色脊髓切片脱腊，以含3％H2Ｏ2甲醇反应5min。加入1∶400稀释的活性型Caspase3抗体(北京博奥森公司)，在4℃湿润的反应盒内反应一夜晚。以PBS清洗3次，各5min。滴加DakocytomationEnvision(+)增强剂，37℃下反应1h。PBS清洗2次，DAB显色。细胞核染成茶色者，判断为活性型Caspase3阳性细胞。选择一侧脊髓前角、后角、后索共3个区域，区域中心确定方法为：中心管和前角顶点连线的中点(黄色方框)、中心管和后角顶点连线的中点(蓝色方框)、灰质背侧表面和脊髓背侧表面最

7、短距离连线中点(红色方框)(图1)。每个区域中心用400倍光学显微镜观察并照像，照片上Caspase3阳性细胞计数3次，取平均值。　　1.3.3电镜观察取脊髓损伤中心1mm脊髓标本，以2％戊二醇固定2h，然后以1％锇酸固定，脱水，以Epon812包埋。制作组织薄片以双氧铀醋酸铅柠檬酸盐染色，用电子显微镜(JEM100CXⅡ)观察脊髓超微结构损伤，并采用Kaptanoglu［4］评分，评分越高代表脊髓损伤越重。　　1.4统计学分析　　使用SPSS11.0统计学软件包，采用非参数秩和检验，组间比较采用MannWh