小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究

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1、小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究作者：解琳娜,王健民,邱慧颖,高磊,周虹,龚胜兰【摘要】　　本研究目的是分离富集小鼠骨髓间充质干细胞（mMSC），鉴定其生物学特性和多向分化潜能。取4-5周龄雄性C57BL/6小鼠骨髓细胞，采用全骨髓贴壁法和单克隆培养法分离、纯化和扩增mMSC；分析细胞免疫表型、生长曲线、细胞周期；进行多向分化潜能鉴定；传代培养达30代后，进行成瘤性检测。结果表明：建立的小鼠间充质干细胞系在体外可连续传代培养达30代，细胞仍保持多向分化潜能，细胞高表达CD29、CD44、Sca1、MHCⅠ，中度表达CD13、CD

2、90.2，不表达CD117、CD45、Flk1、MHCⅡ类抗原。mMSC体外能诱导分化成骨、脂肪、软骨细胞。结论：全骨髓贴壁法和集落培养法富集可获得mMSC，其在体外连续传代30代以上仍能维持生物学特性稳定，具有高度的增殖和多向分化潜能，无成瘤性。【关键词】间充质干细胞　骨髓　细胞培养　生物学特性　　EnrichmentandBiologicalCharacteristicsofMurineMesenchymalStemCellsAbstractThestudyedtoisolateandestablishmesenchymalstem

3、celllinefromadultmurinebonemarroarroursandtibiasof45aleC57BL/6mice,and2.mMSCsarroonoclonalculture.Thecharacteristicsofthecells,suchasmorphology,groultipotentdifferentiationpotential,cytogeicstabilityandtumorigenesisined.Theresultsindicatedthatthecellpopulationconsistedof

4、spindleandstarshapedcells,theyoderatepositiveforCD13,CD90.2andnegativeforCD117,CD45,Flk1andMHCⅡ.mMSCscouldbeinducedtodifferentiateintoadipocytes,osteoblastcellsandchondrocytes.ItisconcludedthatmMSCcanbeisolted,expandedandenrichedbyusingbonemarroonoclonalculture.Notumor

5、formationsareobservedfor3monthsinnudemiceaftersubcutaneousinjection.mMSCsretainthEirpropertiesafteratleast30passagesincultureasfrozenstocks.Keyesenchymalstemcell;bonemarroatol2007;15(3):542-546间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）是来源于中胚层的一种成体干细胞，MSC易于富集和扩增，不涉及伦理学问题，已被越来越广泛地应用到组

6、织工程中,是理想的种子细胞。目前已从大鼠［1］、猫［2］、狗［3］、狒狒［4］、兔［5］、猪［6］、山羊［7］、绵羊［8］等多种哺乳类动物中成功分离MSC。由于小鼠MSC的分离、纯化较其它动物困难，故这方面的报道相对少见。然而，小鼠与人类基因有90%同源性，是非常好的生理和病理的哺乳动物模型，如果能分离、纯化小鼠MSC，并应用到动物模型的研究中，就可以更好地推进MSC的临床研究，为其广泛应用打下基础。故我们进行了小鼠间充质干细胞分离、富集培养，并对其生物学特性进行了分析。材料和方法主要材料DMEMLG（Gibco公司产品）；胎牛血清（Hy

7、clone公司产品）；小鼠单克隆抗体PECD13、MHCⅠ（Serotec公司产品）；抗小鼠单克隆抗体PECD29、CD44、CD90.2、CD117、Sca1、Flk1、MHCⅡ、PE/Cy5CD45（Biolegend公司产品）。L谷氨酰胺、青链霉素、地塞米松、1甲基3异丁基黄嘌呤（IBXM）、吲哚美辛、牛胰岛素、β甘油磷酸钠、维生素（均为Sigma公司产品）。实验动物雄性C57BL/6小鼠，3-4周龄，购自第二军医大学实验动物中心。mMSC的原代培养及传代培养用颈椎脱臼法处死小鼠，于75%乙醇中浸泡5分钟，无菌条

8、件下冲取小鼠骨髓细胞；用维持培养液（DMEMLG+10%FBS+4mmol/LL谷氨酰胺+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素）重悬，按1×106/cm2接种，于37