氯化两面针碱体外诱导人口腔鳞癌kb细胞g2-m期阻滞及凋亡的研究

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1、氯化两面针碱体外诱导人口腔鳞癌KB细胞G2/M期阻滞及凋亡的研究作者：刘华钢王博龙秦三海杨斌【摘要】目的探讨氯化两面针碱对人口腔鳞癌KB细胞周期和凋亡的影响及相互关系。方法应用MTT比色法测定氯化两面针碱对细胞增殖的抑制作用；流式细胞术（FCM）检测氯化两面针碱对细胞周期的影响；Hoechst33258检测细胞凋亡；透射电镜观察细胞超微结构。结果氯化两面针碱在体外呈浓度依赖性显著抑制KB细胞的生长，48hIC50为（2.36±0.22）μg/ml；与空白组相比，经3μg/ml氯化两面针碱作用，G2/M期细胞比例显著增多；6μg

2、/ml时凋亡细胞比例最高，可见典型的核染色质凝集、碎裂；9μg/ml时，细胞凋亡率明显下降，同时镜下可见大量坏死细胞。结论氯化两面针碱抗KB细胞的方式与其剂量密切相关,低浓度时以G2/M期阻滞为主，中浓度时诱导凋亡，高浓度时则致其坏死。【关键词】氯化两面针碱G2/M期阻滞凋亡坏死KB细胞　　Abstract：ObjectiveToexploretheinfluenceofnitidinechlorideoncellcycleandapoptosisofhumancarcinomaofmouthfloorKBcellsandth

3、Eirrelationship.MethodsTheproliferationinhibitionrateandIC50(48h)ofnitidinechloridetoKBcellsinedbyMTTassay.Theinfluenceofnitidinechlorideoncellcycleeasuredbyfloetry.Hoechst33258technologyissionelectronmicroscopearkedlysuppressedproliferationofKBcellsinadose-dependen

4、tmannerinvitro,IC50for48hl.paredlofnitidinechloride，thepercentageofG2/Mphasecellssignificantlyincreased.Thehighestapoptoticpercentageandtypicalnuclearchromatinecondensationandfragmentationl.期阻滞效应。氯化两面针碱能否诱导肿瘤细胞凋亡尚未见报道，我们以人口腔鳞癌细胞KB为研究对象，系统研究了氯化两面针碱对人口腔鳞癌KB细胞周期和凋亡的影响及

5、相互关系。现报道如下。　　1材料与方法　　1.1试剂氯化两面针碱购自中国药品生物制品检定所(批号11084820001，纯度>98%)；胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)购于AMRESCO公司；RPMI1640培养基购于美国GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司；Hoechst33258购自北京普利莱基因技术有限公司；RNase购自MBI；PI：Sigma。　　1.2仪器　EpicsXLII型流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司产品，使用MuticycleAV分析软件；酶联免疫检测仪Model45

6、0：BioRad，USA；荧光显微镜：LEIcaDMR+Q550,Germany；JEM1200EX型透射电镜；CO2培养箱：FormascientificInc。　　1.3细胞培养人口腔鳞癌细胞KB购自中国科学院细胞库，置37℃，5%CO2的培养箱中，用含10%新生牛血清以及青链霉素各100U/ml的RPMI1640培养液培养。倒置显微镜观察细胞生长情况,0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。　　1.4MTT法检测细胞存活率将氯化两面针碱用DMSO助溶，用基础培养基依次对半稀释成五个梯度的母液，调整各浓度

7、中DMSO含量至一致。取对数生长期细胞,以每孔0.19ml（约0.3×104个/孔）接种于96孔板，培养12h待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的氯化两面针碱10μl，使其终浓度分别为12，6，3，1.5，0.75μg/ml，对照组加含等浓度DMSO的基础培养基。每个梯度设4个复孔，其中DMSO终浓度为0.5%,孵育48h每孔加入10μlMTT（5mg/ml），继续培养4h后倾去培养液，加入DMSO0.15ml/孔，平板震荡器振荡5min，充分溶解蓝紫色颗粒，空白孔调零，用酶标仪以570nm/630nm双波长测定去除本底光吸收值后

8、的吸光度值，实验重复3次,Bliss法计算IC50。　　1.5流式细胞仪检测细胞周期收集3μg/ml氯化两面针碱处理0，12，24，48h的细胞，PBS冲洗2次，用70%乙醇4℃固定过夜，PBS洗涤离心去上清，加入适量含100mg/LRNaseA和50mg/LPI的染液，调整