ves诱导口腔鳞癌tca8113细胞凋亡的实验研

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1、VES诱导口腔鳞癌Tca8113细胞凋亡的实验研【关键词】VES；,口腔鳞癌；,bax基因【摘要】目的明确VES对口腔鳞癌细胞Tca8113的作用，为临床应用VES防治口腔鳞癌提供科学的实验数据。方法RTPCR法检测促凋亡基因bax在mRNA水平上的表达，ethodsUsingRTPCRdetectedandquantifiedtheexpressionofbaxmRNA.I1640培养基购自Gibco公司，bax基因引物：5′TGGCGATGAACTGGACAACAAC3′,5′CCCGAAGTAGGAAAGGAGGC3′；actin基因引物5′AACCGTG

2、AAAAGATGACCCAG3′,5′CTCCTGCTTGCTGATCCACAT3′。　　1．2方法　　1．2．1细胞培养Tca8113细胞接种于细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清，100U/ml青霉素、链霉素的RPMI1640培养液，培养于37℃、5%CO2培养箱中，每3~4d传代1次。　　1．2．2反转录聚合酶链式反应（RTPCR)：选取实验组、对照组细胞，加入1mlRNAexReagent，将细胞并RNAexReagent一起移入Ep管中。室温静置5min，再加入200μl氯仿，用力颠倒Ep管混匀。静置5min后，12000r/min10min。小心将上层

3、水相移至Ep管中，加入500μl异丙醇，振荡混匀，室温静置8min。高速离心5min，小心弃上清。加入1ml75%乙醇，振荡片刻，7500r/min5min，小心弃上清。室温静置12min使RNA沉淀恰好干燥，加入水溶解RNA。720分光光度计上测260nm、280nm的OD值，计算RNA的浓度。取等量RNA、OligdT、DEPC水共13μl。70℃加热8min，立即将微量离心管冰浴至少1min，然后加入下列试剂：5′buffer5μl，dNTPs5μl，MMLVRT1μl，Rasin1μl，轻轻混匀，放入37℃恒温水浴锅中60min。90℃，2~3min。5

4、0μl反应体系：灭菌三蒸水34μl，引物11μl，引物21μl，10′buffer(MgCl22.5mmol/L)5μl，dNTPs5μl，Taq酶1μl，cDNA3μl，混匀，7500r/min30s，石蜡油覆盖。PCR循环参数设置：预变性94℃350s，变性94℃60s，退火60℃60s，延伸72℃60s，再延伸72℃300s，共35个循环。　　1．2．3in。转膜后放入5%脱脂奶粉、003%叠氮钠的TBS中平衡1h。加一抗，摇床上作用8h。TBST漂洗3次，每次5min。加二抗，摇床上作用2h。ECL荧光显影液加膜上1min，终止反应，暗室内显影，定影。　

5、　2结果　　2．1RTPCR结果bax基因经PCR扩增后，15%的琼脂糖凝胶上电泳，在EagleEyeⅡ凝胶成像分析仪上可以看到图1的条带，为使实验有一定的可比性，设置内参actin，其中对照组亮度明显低于VES作用6、12、24h的亮度。bax基因与actin基因条带的灰度比值见表1。　　图1bax基因在mRNA水平上的表达随时间的变化图（略）　　表1bax基因和actin基因条带的灰度比值（略）　　与对照组相比P＜005　　2．2an等对维生素E和β胡萝卜素预防肿瘤的研究表明［５］，服用维生素E的受试者中，肿瘤的发病率降低32%，死亡率降低41%，由此维生素

6、E防治肿瘤受到极大的关注。2000年以美国国立肿瘤研究所做了大规模的临床实验［6］，大约有32000美国男性参与此实验，受试者每日服用200μg硒和400国际单位的合成维生素E，研究发现维生素E不仅能降低肿瘤的发病率和死亡率，而且对体外培养的肿瘤细胞有较高的细胞毒性。VES是维生素E的酯化衍生物，与维生素E及其衍生物相比，VES的功能有严格的选择性，它能诱导变异细胞和癌细胞凋亡，并能促进正常细胞分化［7~9］。然而VES对口腔鳞癌的抑制作用尚未见报道。结果显示VES能抑制口腔鳞癌细胞生长并诱导细胞凋亡，VES作用于口腔鳞癌细胞3h后细胞活率显著降低；随着VES作

7、用时间的延长，LDH释放增加，反映了鳞癌细胞膜的受损越来越严重。从流式细胞仪检测结果看到VES引起细胞死亡的方式主要是凋亡，VES作用24h后凋亡的鳞癌细胞达到最大峰值（结果正在进一步整理中）。本文RTPCR反应是以鳞癌细胞总RNA为模板，依据bax的cDNA设计引物，对其进行mRNA水平上的半定量，并利用Western实验在蛋白水平上也进行了定量，结果显示促凋亡基因bax无论在mRNA水平还是在蛋白水平其表达量在VES作用的24h内持续增加，提示其持续增加可能导致了鳞癌细胞的凋亡。当然细胞凋亡的发生不仅取决于bax基因，还受到其他基因如bcl2家族的影响，因此

8、VES诱导鳞癌细胞凋亡的