ves诱导口腔鳞癌tca8113细胞凋亡的实验研究

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1、VES诱导口腔鳞癌Tca8113细胞凋亡的实验研究　　【关键词】VES；口腔鳞癌；bax基因　　【Abstract】ObjectiveToprobeintovitaminEsuccinateforselectiveantitumouractivityinoralsquamouscellcarcinomas.MethodsUsingRTPCRdetectedandquantifiedtheexpressionofbaxmRNA.I1640培养基购自Gibco公司，bax基因引物：5′TGGCGATGAACTGGACAACAAC3′,5′CCCGAAGTAGGAA

2、AGGAGGC3′；actin基因引物5′AACCGTGAAAAGATGACCCAG3′,5′CTCCTGCTTGCTGATCCACAT3′。　　1．2方法　　1．2．1细胞培养Tca8113细胞接种于细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清，100U/ml青霉素、链霉素的RPMI1640培养液，培养于37℃、5%CO2培养箱中，每3~4d传代1次。　　1．2．2反转录聚合酶链式反应（RTPCR)：选取实验组、对照组细胞，加入1mlRNAexReagent，将细胞并RNAexReagent一起移入Ep管中。室温静置5min，再加入200μl氯仿，用力颠倒Ep管混匀。

3、静置5min后，12000r/min10min。小心将上层水相移至Ep管中，加入500μl异丙醇，振荡混匀，室温静置8min。高速离心5min，小心弃上清。加入1ml75%乙醇，振荡片刻，7500r/min5min，小心弃上清。室温静置12min使RNA沉淀恰好干燥，加入水溶解RNA。720分光光度计上测260nm、280nm的OD值，计算RNA的浓度。取等量RNA、OligdT、DEPC水共13μl。70℃加热8min，立即将微量离心管冰浴至少1min，然后加入下列试剂：5′buffer5μl，dNTPs5μl，MMLVRT1μl，Rasin1μl，轻轻混匀

4、，放入37℃恒温水浴锅中60min。90℃，2~3min。50μl反应体系：灭菌三蒸水34μl，引物11μl，引物21μl，10′buffer(MgCl22.5mmol/L)5μl，dNTPs5μl，Taq酶1μl，cDNA3μl，混匀，7500r/min30s，石蜡油覆盖。PCR循环参数设置：预变性94℃350s，变性94℃60s，退火60℃60s，延伸72℃60s，再延伸72℃300s，共35个循环。　　1．2．3in。转膜后放入5%脱脂奶粉、003%叠氮钠的TBS中平衡1h。加一抗，摇床上作用8h。TBST漂洗3次，每次5min。加二抗，摇床上作用2h。

5、ECL荧光显影液加膜上1min，终止反应，暗室内显影，定影。　　2结果　　2．1RTPCR结果bax基因经PCR扩增后，15%的琼脂糖凝胶上电泳，在EagleEyeⅡ凝胶成像分析仪上可以看到图1的条带，为使实验有一定的可比性，设置内参actin，其中对照组亮度明显低于VES作用6、12、24h的亮度。bax基因与actin基因条带的灰度比值见表1。　　与对照组相比P＜005　　3讨论　　1998年美国研究人员Hartman等对维生素E和β胡萝卜素预防肿瘤的研究表明［５］，服用维生素E的受试者中，肿瘤的发病率降低32%，死亡率降低41%，由此维生素E防治肿瘤受到

6、极大的关注。2000年以美国国立肿瘤研究所做了大规模的临床实验［6］，大约有32000美国男性参与此实验，受试者每日服用200μg硒和400国际单位的合成维生素E，研究发现维生素E不仅能降低肿瘤的发病率和死亡率，而且对体外培养的肿瘤细胞有较高的细胞毒性。VES是维生素E的酯化衍生物，与维生素E及其衍生物相比，VES的功能有严格的选择性，它能诱导变异细胞和癌细胞凋亡，并能促进正常细胞分化［7~9］。然而VES对口腔鳞癌的抑制作用尚未见报道。结果显示VES能抑制口腔鳞癌细胞生长并诱导细胞凋亡，VES作用于口腔鳞癌细胞3h后细胞活率显著降低；随着VES作用时间的延长

7、，LDH释放增加，反映了鳞癌细胞膜的受损越来越严重。从流式细胞仪检测结果看到VES引起细胞死亡的方式主要是凋亡，VES作用24h后凋亡的鳞癌细胞达到最大峰值（结果正在进一步整理中）。本文RTPCR反应是以鳞癌细胞总RNA为模板，依据bax的cDNA设计引物，对其进行mRNA水平上的半定量，并利用essingEM,etal.VitaminEsuccinateinhibitsthefunctionofandrogenreceptorandtheexpressionofprostatespecificantigeninprostatecancercells［J］.P

8、rocNatlAcadSciUSA，2