硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导hl60细胞凋亡实验研究

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1、硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL60细胞凋亡实验研究作者：孙启鑫，孟凡义，扶云碧，李利【摘要】　　本研究探讨硼替佐米（bortezomib，Bor）单用或联合三尖杉酯碱（harringtonine，HT）对HL60细胞凋亡的影响。以不同浓度Bor、HT处理HL60细胞12-48小时，采用MTT比色法检测细胞增殖活性，以DNA凝胶电泳、荧光显微镜检、流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明：10-50nmol/LBor可有效抑制HL60细胞增殖，并诱导其凋亡。其中10nmol/L剂量处理12小时即有细胞凋亡发生，延长作用时间

2、或增加药物剂量可使细胞凋亡率明显增加。30nmol/LHT与10nmol/LBor联合应用时，可见HL60细胞凋亡率比两种药物单独使用时显著增加。结论：Bor对HL60细胞具有时间和剂量依赖性的细胞凋亡诱导效应，与HT联合应用有明显的协同作用。【关键词】硼替佐米；三尖杉酯碱；凋亡　　InductionofApoptosisinHL60CellsbyBortezomibaloneorinbinationofthisstudyibaloneandinbinationib,harringtonineindifferentconce

3、ntrationsfor12-48hours.Cellproliferationicroscopyandfloetry.Theresultsshool/LbortezomibcouldeffectivelyinhibitHL60cellproliferation,andinduceditsapoptosis.Aftertreatingfor12hours,10nmol/Lbortezomibcouldtriggercellsapoptosis.I1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品，MTT、Hoec

4、hst33342、碘化丙锭（PI）、RNA酶A、蛋白酶K均为Sigma公司产品。硼替佐米（bortezomib、Velcade、万珂）为美国Millennium公司产品（西安杨森制药有限公司惠赠），用无菌水配成1mg/ml浓度备用。三尖杉酯碱注射液为北京协和制药厂产品，使用时稀释到实验所需的浓度。细胞培养HL60白血病细胞株购自天津血液病研究所，用含10%小牛血清RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2条件下培养，1-2天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。中国实验血液学杂志JExpHematol2007;15(2)硼替佐米

5、或联合三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡实验研究研究方案依预试验结果，选择Bor（10-50nmol/L）和HT（7.5-75nmol/L）分别单独处理HL60细胞12-48小时，观察药物剂量反应效应。根据药物反应结果，选择HTIC50剂量与Bor各浓度联合，观察药物联合后对HL60细胞的协同效应。细胞增殖活性MTT检测对数生长期细胞调整密度为1×105cells/ml，每孔100μl接种，按要求加入不同浓度处理药物，终体积200μl/g/ml），继续孵育4小时。离心并吸弃上清，加DMSO170μl/OD值（A）。细胞活力计算:

6、细胞活力（%）=（A处理组－A调零组/A对照组－A调零组）×100%细胞形态学观察Hoechst33342以终浓度10μg/ml加入培养板各处理组细胞中，避光染色15分钟，倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。DNA提取及电泳参照统计学分析所有实验至少重复3次，应用SPSS10.0软件进行数据分析，均数比较采用t检验，设定P＜0.05为显著性差异。结果HL60细胞增殖活性10-50nmol/LBor对HL60细胞的增殖均有一定抑制作用，表现为时间剂量依赖关系，随浓度增加和时间延长抑制效果逐渐增强（图1），其24小时的IC50为2

7、0nmol/L。30nmol/L剂量处理12-48小时，细胞抑制率与对照组相比差别均有显著性意义（P<0.01）；作用24小时时，抑制效果达到最大，但与48小时相比差别无统计学意义（P=0.328），而与12小时或18小时相比，抑制效果明显增强，有显著性意义（P=0.002、P=0.011），其余浓度也均可见类似规律。以7.5、15、22.5、30、37.5、56.2、75nmol/LHT处理HL60细胞24小时，细胞活力分别下降为对照的92%、82%、61%、47%、33%、23%、21%，也显示出明显的剂量依赖性抑制效

8、应，其24小时的IC50剂量约为30nmol/L。选择30nmol/LHT与Bor各浓度联合，可见在达到最大抑制效果前，联合处理组对细胞的抑制作用比同剂量两药任一种单独使用时都显著增强(P＜0.01）（图2）。细胞形态学改变Hoechst33342