硼替佐米增强胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性及机理研究

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1、中国医科大学博士学位论文硼替佐米增强胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性及机理研究姓名：刘静申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：刘云鹏20090301除NF一1cB外，其它信号传导通路也参与TRAIL耐药。Phosphatidylinositol3-kinase(P13K)／Akt是重要的信号通路，可调控细胞生存，增殖及凋亡。它可被多种刺激激活，通常发挥抗凋亡作用。有报告P13K／Akt信号通路与TRAIL耐药有关。使用特异性抑制剂或小RNA干扰阻断P13K／Akt通路可逆转一些细胞对TRAIL的原发耐药。关于

2、增强TRAIL敏感性的研究已在多种肿瘤细胞中进行，如肺癌和结肠癌等。近年来的研究显示一些化学制剂可增强胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，但是目前为止这些制剂都不能用于临床治疗。硼替佐米是一种新发现的蛋白酶体抑制剂，已经被美国食品与药品管理局(U．S．FoodandDrugAdministration，FDA)批准用于多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的治疗。硼替佐米的主要抗肿瘤功能是阻止NF一1cB的抑制体IrJ3在蛋白酶体中降解，从而阻断N卜1cB活化。有报告硼替佐米可与TRAIL协同，增强TRAIL对一些原发耐药细

3、胞诱导的凋亡，如非小细胞肺癌，卵巢癌和胰腺癌。这些结果鼓励我们将硼替佐米与TRAIL联合用于胃癌的治疗。本研究以三种胃癌细胞系为模型，研究硼替佐米对TRAIL诱导细胞凋亡的影响，包括caspase裂解，线粒体膜电位的变化和对凋亡相关蛋白的影响，以及NF—lcB和P13K／Akt通路在TRAIL诱导凋亡中的作用。材料与方法1．采用MTT方法测定细胞活力，绘制生存曲线。2．采用流式细胞术PI染色进行细胞凋亡及细胞周期检测3．采用流式细胞术DiOC6染色测定线粒体膜电位变化。4．采用Westernblot法检测蛋白的表达

4、。5．采用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染。6．统计学分析：数据以均数±S表示。两组间差异采用Student’Sttest分析。P<0．05认为有统计学意义。实验结果一、硼替佐米增强胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性21．50ng／mL的TRAIL作用于三种细胞24h后，细胞存活率分别为72．67士4．93％，92．33+5．86％，和98．33+2．31％。延长TRAIL作用时间至1]48h，或提高TRAIL浓度至1000ng／mL，均不能进一步增强TRAIL的毒性．流式细胞术PI染色结果提示

5、TRAIL作用24h后，三种细胞系中亚二倍体比率不足8％。2．50nM硼替佐米单独作用胃癌细胞仅引起轻度细胞死亡。50nM硼替佐米预处理可增强TRAIL对三种胃癌细胞的毒性。在MGC803细胞，联合用药可将细胞活力从70．42+1．14％减低到34．85+2．83％，细胞凋亡从8．22+0．83％增强到31．27士2．02％。类似的协同作用也见于另两种细胞系。3．50瑚硼替佐米和50ng／mLTRAIL单独作用于三种胃癌细胞系，24h后均可见到线粒体跨膜电位的下降。硼替佐米预处理2h后再予TRAIL作用24h，线粒

6、体跨膜电位被进一步降低。在MGC803细胞，TRAIL单独作用24h可使线粒体跨膜电位下降10．97+4．56％，硼替佐米联合TRAIL可使线粒体膜电位下降54．27+7．71％，与TRAIL单药相比有统计学意义，P<0．05．在SGC7901，BGC823细胞中，硼替佐米预处理也可进一步增强TRAIL引起的线粒体跨膜电位下降，但是与TRAIL单药相比无统计学差异。4．50nM硼替佐米预处理三种细胞系2h后，加入50ng／lIILTRAIL继续作用12h，三种细胞系中G2／M期细胞比率明显增加。与TRAIL联用并未

7、进一步增加G2／M期阻滞。5．TRAIL或硼替佐米单独作用于SGC7901细胞24h均不能诱导caspase8活性片段的产生，但二者联用可明显裂解caspase8，继而裂解caspase3，同时Caspase3及caspase8前体明显减少。相似的caspase变化也见于其它两种胃癌细胞系。硼替佐米联合TRAIL对死亡受体DR5，凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax的表达无明显影响，但是可轻度下调cIAP一1的表达。硼替佐米单药可明显上调Survivin表达，与TRAIL联用并未进一步增加表达上调。二、TRAIL活化NF

8、-KB通路阻止胃癌细胞凋亡ng／mLTRAIL处理SGC7901细胞30rain后可活化NF—r．B，Westernblot3可检测到清晰的Ir,B降解。而TNF可于更早时间激活NF-r．B，在处理后15rain即可检测到Ir,B降解，且其降解程度明显强于TRAIL诱导的Ir,B降解。2．用空载体或编码磷酸化缺陷突变型HA标记Ir．B(HA．It．B)的cD