矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成ⅰ型胶原的实验研究

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1、矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究作者：袁芳，李厚轩，金峰，郑瑜谦，闫福华【摘要】　　目的观察矿化诱导培养能否促进冻存骨髓基质细胞（BMSCs）在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原，为牙周组织工程中选择适宜的种子细胞的保存和培养条件提供参考。方法体外分离培养Beagle犬BMSCs，经冻存12个月后，在矿化诱导培养液（矿化诱导组）或基础培养液（非矿化诱导组）中形成BMSCs胶原膜支架复合物，将矿化诱导培养液处理的单纯胶原膜支架(空白对照组)、2种BMSCs胶原膜复合物分别植入裸鼠背部皮下组织中，术后

2、第4周行组织病理学和免疫组织化学观察，分析各组标本中的Ⅰ型胶原形成量。结果空白对照组植入胶原膜后，新生胶原分布很少；非矿化诱导组胶原分布明显增多；矿化诱导组中见大量新生的胶原形成。免疫组织化学光密度测量显示，矿化诱导组(0.1963±0.0126)>非矿化诱导组(0.1489±0.0037)>空白对照组(0.0775±0.0058)（P<0.05）。结论矿化诱导培养能够促进冻存的BMSCs在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原。【关键词】低温保存；骨髓细胞；Ⅰ型胶原；牙周组织；组织免疫组织化学　　ABSTRACT

3、:ObjectiveToexploretheeffectsofosteoinductivecultureonthesynthesisoftypeⅠcollagenbybonemarroalcells(BMSCs)innudemice.MethodsBMSCsfrombeagledogsonths.RecoveredBMSCsedium.Osteoinductiveconditionedcollagenscaffoldalone,osteoinducedandnoninducedBMSCsscaffoldp

4、lexplantedintothesubcutaneoustissuesofnudemicefor4ationp;Estainingandimmunohistochemistry(IHC).ResultsScarcecollagenfibersplantedoderatecollagenfibersinnoninducedBMSCsscaffoldgroup,andlargequantitiesofneedcollagenfibersinosteoinducedBMSCsscaffoldgroup.Enha

5、ncedformationoftypeⅠcollagenationinnoninducedBMSCsscaffoldgroup(0.1489±0.0037)andscaffoldalonegroup(0.0775±0.0058)（P<0.05）.ConclusionOsteoinductiveculturecanenhancetypeⅠcollagenformationinnudemicebycryopreservedBMSCs.　　KEYSCs)是一种能分化为成纤维细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种类型细

6、胞的多能干细胞，在骨组织、软骨组织以及牙周组织缺损的再生医学中有着广泛的应用前景［1］。本课题组前期研究发现，冻存BMSCs复苏传代后，在体外培养条件下仍保持了较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力，并且具有未冻存细胞相似的体内促进牙周组织再生的能力［23］。寻找适宜的细胞培养条件对于牙周再生医学有着重要意义。因此，本实验拟研究矿化诱导培养能否促进冻存后的BMSCs在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原，从而为选择适宜培养条件、提高BMSCs体内再生牙周组织的能力提供参考。　　1材料和方法　　　　1.1实验动物及主要试剂　　健

7、康成年Beagle雌性犬（体质量11kg)、BALB/c裸鼠42只(4～6周，体质量18～23g)；新生牛血清(江滨生物，杭州)；DMEM(Gibco，美国)；地塞米松、维生素C和β甘油磷酸钠(Sigma，美国)；BME10X医用胶原膜(北京中国医学科学院生物医学工程研究所)；Ⅰ型胶原抗体、SABC过氧化物酶试剂盒(博士德生物，武汉)；DAB显色试剂盒、EDTA抗原修复液(福州迈新生物技术开发有限公司)。　　1.2方法　　　1.2.1BMSCs的分离与冻存　　采用实验室所用的“改良全骨髓培养法”获取细胞［4］

8、，培养传至第2代；将2.5×106mL-1BMSCs以10%二甲基亚砜、10%新生牛血清、80%DMEM为冻存培养液，按4℃0.5h、-20℃0.5h和-80℃冰箱过夜后放入液氮中，低温保存12个月。　　1.2.2BMSCs的复苏与培养　　冻存的BMSCs在37℃恒温水浴中迅速翻转解冻，离心、弃冻存液，收集细胞于标准环境中培养备用。以含10%的新生牛血清的D