甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞 hl7702凋亡及其机制的研究

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1、甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL7702凋亡及其机制的研究：传良敏，洪华，黄文芳，杨永长，饶绍琴，邓君【摘要】目的观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate,GCDC)对人正常肝细胞株HL7702凋亡的影响，并探讨其凋亡机制。方法终浓度分别为100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL7702细胞24h，光学显微镜观察GCDC对HL7702细胞形态的影响，AnnexinVFITC/PI双染色法检测HL7702细胞的凋亡率，用荧光指示剂Fluo3/AM测

2、定HL7702细胞内钙离子浓度，RTPCR测定Bcl2、Bax基因mRNA表达水平。结果终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL7702细胞24h后，细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变；100、150、200、250μmol/L的GCDC均可诱导HL7702细胞凋亡，呈剂量依赖性，凋亡率分别为(13.16±2.9)%(t=6.41)、(20.3±3.0)%(t=10.22)、(25.02±2.1)%(t=18.11)、(45.02±3.5)%(t=28.89)，较对照组(2.2±0.

3、6)%显著升高(P<0.05)；GCDC能使HL7702细胞内钙离子浓度增加，且具有浓度依赖性；GCDC使细胞内Bcl2mRNA的表达下降、BaxmRNA的表达增加。结论GCDC可能是通过增加HL7702细胞内钙离子浓度，并进一步下调Bcl2、上调Bax表达水平，从而诱导细胞凋亡。【关键词】甘氨脱氧胆酸盐；细胞凋亡；钙离子；Bcl2；Bax；肝细胞ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheapoptosisofculturednormalhumanhep

4、atocyteHL7702cellsinducedbyglycodeoxycholate(GCDC)andtoexploreitspossiblemechanism.MethodsHL7702cellsol/L)ofGCDC.Thechangesofcellularmorphologyicroscope.TheapoptosisrateofHL7702inedbyAnnexinVFITC/PIdoublestaining.ThechangesofHL7702cellintracellu

5、ar[Ca2+]iinedRNAexpressionlevelsofBcl2/BaxinHL7702cellsorphologicalchangesol/LGCDCfor24h;HL7702cellscouldbeinducedtoundergoapoptosisinaconcentrationdependentmannerafter100,150,200,and250μmol/LGCDCtreatmentfor24hours.Theapoptosisratesarkedlyhigher

6、(P<0.05)thanthoseofthecontrolgroup.Theintracellular[Ca2+]iannerRNARNAechanismofapoptosismightberelatedtoincreasingintracellular[Ca2+]i,doRNAandupregulatingtheexpressionofBaxmRNA.KEYI1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自美国GM公司；甘氨脱氧胆酸盐(GCDC)购自Sigma公司；胰酶细胞消化液购自

7、碧云天生物技术研究所；AnnexinVFITC/pI检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；钙离子测定试剂盒购自美国Biotium公司；RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒、DNAmarker、引物合成均由北京赛北盛基因技术有限公司提供。1.3细胞培养将浓度为1×105个/mL的HL7702细胞接种于含100mL/L小牛血清、青霉素100u/mL、链霉素100u/mL的RPMI1640培养基中，在37℃、饱和湿度、50mL/LCO2培养箱中常规培养24h后换液，处理组加入GCDC，使终浓

8、度分别为100、150、200、250μmol/L，同时设立阴性对照组(不加GCDC)，培养24h，收集各GCDC处理组和阴性对照组细胞，用于以下实验。1.4细胞形态学的观察收集150μmol/LGCDC处理组和阴性对照组细胞，离心涂片，瑞氏染色，光镜下观察细胞形态。1.5AnnexinVFITC/PI检测细胞凋亡率收集各GCDC处理组和阴性对照组细胞，用PBS洗涤细胞2次，500μL结合缓冲液重悬浮细胞，加入1μLAnnexinVFITC混匀后再加入5μL碘化丙啶溶液，混匀后室温避光反应5