粪便p16基因甲基化状态在结直肠癌早期诊断的意义

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1、粪便p16基因甲基化状态在结直肠癌早期诊断的意义：凌志安陈利生何纯刚【摘要】目的探索p16基因甲基化状态与结直肠癌(CRC)早期诊断的可行性。方法从61例CRC患者、21例腺瘤患者和20例正常对照者粪便中提取DNA,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)技术分析其p16基因甲基化改变状态。结果CRC、腺瘤、正常对照者粪便标本p16基因甲基化检出率分别为77.0%(47/61)、59.3%(16/27)、5.0%(1/20)。检测p16基因甲基化诊断CRC的敏感性和特异性分别为71.6%和95.0%。p16基因甲基化的阳性状态与CRC患

2、者年龄、性别、肿瘤发生部位无明显关系，p16基因甲基化的阳性状态与肿瘤的Dukes分期、组织分化程度和淋巴结转移有关。结论p16基因甲基化改变发生在CRC形成的早期阶段，检测粪便DNA中p16基因的甲基化状态有望成为CRC早期无创诊断及CRC高风险人群筛查诊断的新途径。【关键词】CRC;粪便;p16基因;甲基化　　[Abstract]ObjectiveToevaluatethepossibilityofp16genemethylationchangeinstoolforscreeningearlycolorectalcancer.Me

3、thodsThDNAfecalsamplesfrom61patientsaand20normalvolunteer,themethylationstatusofp16geneethylationspecificpolymerasechainreaction(nMSP).ResultsMethylated.p16.gene.occurred.in.77.0%(47/61),59.3%(16/27),5.0%(1/20)ofpatientsasandnomal.Thesensitivityandspecificityofp16genem

4、ethylationassayforcolorectalcancerethylationpositiverateofthecolorectalcancerhadnosignificantrelationship.orsiteofthecolorectalcancerpatients.Butthep16genemethylationpositiverateofthecolorectalcancerhadsignificantrelationship.or,thedegreeofdifferentiationandlymphnodem

5、etastasis.ConclusionThep16genemethylationoccurredintheearlystagesofcolorectalcancer.Analysisoffecalp16genemethylationisexpectedtoserveasaneg粪便，采用DNA提取试剂盒“QIAampDNAMiniKit”提取DNA，方法按照试剂盒说明进行。之后在紫外分光光度计上测OD值(OD值均在1.7～1.9之间)，计算出DNA的浓度及总量(DNA量在15～100μg之间)。利用亚硫酸氢盐对DNA进行化学修饰使甲

6、基化及非甲基化的DNA序列产生不同转变。双链DNA变性解链后，在亚硫酸氢盐作用下，未发生甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的C则不发生变化的原理进行DNA的亚硫酸氢盐修饰[4]。　　1.2.2巢式甲基化特异性PCR利用巢式甲基化特异性PCR[5]原理检测p16基因的甲基化状态。巢式甲基化特异性PCR引物为：上游5′GAAGAAAGAGGAGGGGTTGG3′下游5′CTACAAACCCTCTACCCAACC3′。nPCR反应体系为20μL：DNA模板3μL，10×LongTaqBuffer2μL，LongTaqDNA聚合

7、酶0.2μL，dNTP1μL，上下游引物各0.4μL，灭菌用水13μL。PCR反应条件：94℃4min，94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec，以上步骤共35个循环，72℃延伸7min。　　1.2.3甲基化特异性PCR以巢式甲基化特异性PCR反应产物1∶1000稀释为模板,进行MSP扩增。甲基化特异性PCR的引物：p16基因甲基化的引物：p16MF：5′TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC3′,p16MR：5′GACCCCGAACCGCGACCGTAA3′;p16基因非甲基化的引物：p16UF：5′TTATT

8、AGAGGGTGGGGTGGATTGT3′;p16U　　R：5′CAACCCCAAACCACAACCATAA3′。甲基化特异性PCR反应体系为25μL：DNA模板1μL，10×LongTaqBuffer2.5μL，Lo