p16基因甲基化检测在肺癌早期诊断中的应用研究

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1、P16基因甲基化检测在肺癌早期诊断中的应用研宄张继华李晓张毅蔡远玲高明周云春(云南省玉溪市人民医院653100)【摘要】目的釆用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测NSCLC患者pl6基因的甲基化状态，探讨pl6基因甲基化与肺癌发病的关系以及其对肺癌的早期诊断价值。方法实验分两阶段进行。结果A组患者四种标木中P16基因甲基化率分别为50%，46.43%,51.79%,53.57%；B组2例COPD合并吸烟患者支气管肺泡灌洗液，1例痰标木中检测到P16基因甲基化；C组健康对照者标木中均未检测到P16基因甲基化。D组患者四种标木中P16基

2、因甲基化率分别为48.27%,50.00%,56.89%(33/58),58.60%。结论肺癌患者四种标本中P16基因甲基化率明显高于非肺癌患者及健康人，而非肺癌患者(包括慢阻肺病人)和健康人甲基化率无明显差别，检测pl6基因甲基化可用于肺癌的早期诊断及筛查。【关键词】DNA甲基化肺泡灌洗液血清肺癌【中图分类号】R730.4【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)46-0067-02肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，与30年前相比，我国肺癌死亡率上升了465%［1］,肺癌的早期诊断对改善预后至关重要，因

3、此，在我国积极探索发展肺癌的早期诊断研究只有非常重要的现实意义,DNA甲基化水平变化的检测对肿瘤的早期诊断、疗效观察及预后判断提供非常有价值的信息［2］。DNA甲基化与肿瘤的发生密切相关，甲基化可导致抑癌基因、生长调节基因启动子区域的高甲基化，是癌症发生的重要机制［3］。细胞周期依赖的激酶抑制剂在早期肺癌中约有20%出现不同程度的甲基化，而在正常肺组织中这个基因没有发现甲基化的存在［4］。阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子OPCML为一种抑癌基因，被抑制可引发肺癌的尼古丁逆转［5］。研究发现该基因的启动子甲基化与肺鱗癌和腺癌发病相关，在肺

4、鱗癌中发现HOXA7-9的甲基化频率达到45%-80%［6］。CDX是另外一种编码冋源异性盒转录因子的基因，在鳞状食管癌和结肠癌［7］以及肺癌［8】中都发现该基因的启动子区域出现高甲基化现象。Fujiwara等［9］为了评估外周血清DNA甲基化检测诊断早期肺癌的价值，应用甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）技术，对经X线普查发现肺部有异常病灶，需行支气管纤维镜检查的200例患者血清五种肿瘤相关基因DNA甲基化状态进行了检测，结果得出使用一种以上肿瘤相关基因甲基化检测对肺癌诊断的敏感度为49.5%,特异度为85.0%。P16抑癌基因又称MT

5、S1基因或CDKN2基因，是人们发现的第一个直接作用细胞周期抑制细胞分裂的抑癌基因［10］。当抑癌基因pl6发生突变，它的编码蛋白表达水平将会下降或消失，失去原有的生物学功能，导致肿瘤的发生，从分子水平上分析pl6基因表达的机制［11］。随着对甲基化研究的进一步深入和联合分析将有利于提高肿瘤诊断率，必将在肿瘤的早期诊断、监测高危人群、判断肿瘤预后及其它领域得到更加广泛的应用。资料与方法一、一般资料第一阶段研究A组:收集2009-2013年间在本院住院治疗的56例NSCLC患者外周血血清、痰、经支气管镜肺泡灌洗液、活检组织标本。入组条件：

6、经病理组织确诊的NSCLC患者。B组：收集2010-2013年间在玉溪市人民医院住院治疗的20例肺良性疾病患者外周血血清、痰标本、肺泡灌洗液，入组条件：经症状、实验室检查证实为非肺癌患者。C组：收集20例健康者的外周血血清、诱导痰标本作对照组。入组条件：经询问病史、胸部CT、心电图排外肿瘤及心血管病变。第二阶段研宄D组：收集2009-2013年间本院及品明医科人学第一附属医院单侧肺部孤立占位病灶，并接受手术切除的患者79例，术前留取患者外周血、痰液、支气管肺泡灌洗液标本，进行甲基化检测；术后进行病理分析，同吋组织标本进行DNA甲基化检测

7、。入组条件：可疑I期以内肺癌患者(遵照肺癌TNM国际分析)，即肺部CT检查为单侧肺部孤立占位，病灶直径8-15mm,未见到同侧或对侧淋巴结肿大，纤支镜检查未见增生阻塞，经过常规检查不能明确占位性质，愿意接受手术治疗者。四组入选患者一般特征及各参数之间差异无统计学意义，见表一。二、方法2.1按照标准的标本采集方法分别对A、B、C、D四组中的实验对象进行以上四种标本的采集；提取DNA后用甲基化特异性MSP方法进行定性检测。2.2各组实验数据的计算方法：甲基化率(％)=发生甲基化的标本数/总的标本数×100%。2.3应用SPSS1

8、3.0统计软件对分类资料进行χ2检验，若P<0.05,则差异有统计学意义，若P〉0.05,则差异无统计学意义。结果1、A组患者任一标本或者多种标本检测到P16基因甲基化者35例(62.5%)，其中血