反复冻融对荧光实时定量pcr质粒标准品的影响研究

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1、反复冻融对荧光实时定量PCR质粒标准品的影响研究：王亨莉，陈红涛，孔梅，杨冬铭【摘要】目的评价反复冻融对不同浓度的real-timePCR质粒标准品的影响。方法用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒，紫外分光光度计定量后，根据重组质粒分子量计算其拷贝数，稀释成梯度浓度的荧光实时定量PCR的标准品，取1.0×106拷贝/μl、1.0×104拷贝/μl和1.0×102拷贝/μl高中低3个浓度的标准品，反复冻融1次，6次，11次，16次和21次后，以冻融后的质粒标准品为模板同时进行real-timePCR扩增定量，比较量值变化。结果

2、反复冻融21次以内，高中值稳定，低浓度波动相对较大，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。结论>1.0×104拷贝/μl的高中浓度的质粒标准品可以耐受21次以内反复冻融，低于1.0×104拷贝/μl的质粒标准品反复冻融后量值变化较大，临床使用的试剂盒所配的低浓度标准品应避免反复冻融。【关键词】实时定量PCR;质粒DNA标准品　　【Abstract】ObjectiveToevaluatefreezingandthaidDNAstandardsforfluoresc

3、encequantificationreal-timePCR.MethodsTherebinantPMT-18plasmididstocksinedbytheEppendorfBiophotometer,andthecopynumberofeachplasmidolecularidstandardsadebypreparingserial10-folddilutions,theplasmidstandardsidstandards1,6,11,16and21timesrepeatedly,quantityvaluediversityofdiffer

4、entconcentrationstandardsedbyreal-timePCR.ResultsFreezingandthaes,andthereidconcentrationsofplasmidstandards,butloidstandardsidsidconcentrationplasmidsidsidstandardsmorethan1.0×104copies/μlisstablees,plasmidstandardslessthan1.0×104copies/μlisaffectedafterfreezingandthaequantit

5、ativePCR;plasmidDNAstandard　　基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR快速高效，灵敏度和特异性高，无需PCR后处理，是目前疾控系统和临床检验定量检测核酸应用最为广泛的一种方法[1～3]。实时荧光定量PCR的质量保证最为重要的一个因素就是标准品，定量结果的准确性在很大程度上依赖于标准品的准确性。目前实时荧光PCR定量标准品大多为重组质粒[4～7]，重组质粒为裸露的螺旋缠绕的双链闭环DNA，质粒在低温条件下可长期稳定保存，与目的基因保持较高的同源性，两者一致的扩增效率是得到较为可靠的定量结果的保证。裸露的双链DNA化学稳

6、定，但物理结构易碎，在受到搅拌、振荡或反复抽吸时，DNA双链容易被拉断，结构被破坏后，DNA序列不再完整，参与PCR反应时扩增效率降低，影响定量[8]。反复冻融的过程中，液固状态的体积会发生变化，对DNA质粒结构会产生力学作用。本实验结合临床检验人员的工作经验，研究实时荧光定量PCR诊断试剂盒临床检测中可能的冻融次数对不同浓度的质粒标准品的影响。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1质粒本研究所用的实时定量PCR的DNA重组质粒购自北京迅必达基因技术公司，质粒母液浓度>1.0×1010拷贝/μl。　　1.1.2主要试剂和仪器质粒DNA抽

7、提试剂盒(美国OMEGA公司);BlendTaqplusDNA聚合酶(日本TOYOBO公司);easydilutionDNA稀释液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP(日本TaKaRa公司);DTCSTMQuickStart测序试剂盒(美国BeckmanCoulter公司)。紫外分光光度计(德国Eppendorf公司);SmartcyclerIIrealtimePCR仪(美国Cephied公司);CEQTM8000测序仪(美国BeckmanCoulter公司)。实验室自配试剂有：LB液体培养基(称取胰蛋白胨10g、酵母提取液5g、NaCl10g

8、，加水800～900ml搅拌至溶解。用5MNaOH调pH=7.4，定容至1L，混匀，高压灭菌，冷却后加入80mg/ml的A