浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解

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1、浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解实时荧光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR,RT-qPCR)是一种实时监控DNA扩增反应的技术。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累进行实时监测整个PCR过程，并将DNA的累积速率绘制成动态变化图，在扩增的指数期对起始模板进行定量，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变界系数的问题。该项技术于1996年市美国AppliedBiosystems公司推出，促使PCR技术从定性到定量的飞跃，而且集特异性强、自动化

2、程度高、灵敏度好、污染少等优点为一体，现已在生物研究、医药、食品等领域得到广泛应用。1RT-qPCR的基本原理和应用1.1基本原理RT-qPCR的分类方法根据其化学原理可分为探针类和非探针类两种，下面以TaqMan探针类和SYBRGreenI非探针类两种常见方法简述其原理。1.1.1TaqMan探针法TaqMan探针是一种长度为20-24bp寡核昔酸探针，在其5’末端标记一个荧光报告基团(reporter,R),在3’末端则标记一个荧光淬灭基团。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入TaqMan荧光探

3、针,其结合位点在两条引物之间，只与模板特异地结合。当完整的探针与目标序列杂交时，荧光基团发射的荧光信号与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，将DNA探针逐个降解，使得荧光基团与淬灭剂分离。这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间呈正比，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。如下图1-1至图1-11所示为TaqMan探针工作原理简图：荧光共振能量转移，FRET淬灭基团报告荧光fm1⑷5'-3'外切酶活性i11i111115=3,外切酶活性Ll111

4、111报告基团和淬灭基团分离而发光1.1.2SYBRGreenI染料法SYBRGreenI荧光染料是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA双链的小沟区域，其最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm.特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。因此，根据荧光信号检测出PCR体系中存在的双链DNA数量。如图1-12和图1・13为SYBRGreenI工作原理简图：合1.1.3两种方法的优缺点总而言之，探针类是利用与靶序列特异性结合的探针来指示扩

5、增产物的增加,非探针类则是利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但价格昂贵。后者可以与所有的双链DNA相结合，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低，更简便易行。特别地，由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。可以通过测量升高温度后荧光的变化帮助降低非特界产物的影响，由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量结果。1.2RT-qPC

6、R技术的主要应用1.2.1医学领域RT-qPCR技术目前应用最为广泛的是医学领域，包括病原体的检测，例如病毒、细菌、病原体的定量监测及治疗药效评价；基因的点突变及单核昔酸多态性（SNP）分析；临床疾病的诊断，如各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病诊断，肿瘤基因的检测和诊断等。1.2.2植物中的应用RT-qPCR技术是一种很好的检测基因表达的方法，通过RT—qPCR可以分析植物在不同处理条件下基因样本的表达差异，也可以分析植物在不同生长发育时期基因表达的差异。该项技术的应用对植物病理学研究和植物遗传育

7、种研究起到了推进作用。1.2.3食品安全应用RT-qPCR技术对食品屮的微生物进行检测和研究，不仅可以对活体微生物核酸量进行检测，还可以对已死的生物进行检测。该项技术的应用也使得转基因食品的检测突破了从定性到定量的界限。1.2.4其他科学研究此外，RT-qPCR技术在其他分子生物学相关定量研究领域的应用也取得了较大进展，如：在动植物基因工程、微生物鉴定与分类、昆虫分类和鉴定中的应用及昆虫检疫等。2—般实验步骤在进行实时荧光定量PCR前，主要有RNA样品抽提、RNA质量检测、样品cDNA的合成，引物设

8、计合成及其他药品购买，选择合适的荧光定量方法等。在正式试验前需进行验证实验，以确定扩增效率（一般大于1.9为有效）、动力学范围，确保准确度、精密度。接着需要做的有：梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（B・actin）实时定量PCR、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板、待测样品的待测基因实时定量PCR、电泳检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带及数据分析。特別地，学院现有的7500型实时荧光定量PCR仪可同时实现特异性靶基因检测与定量。7500型实时荧光定量PC