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1、实时荧光定量PCR技术的实验研究摘要实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。 关键词荧光定量PCR技术;原理;主要类型;定量方法;优化 AbstractReal-timefluorescentquantitativePCRisaneentprinciples,themaintypesandquantitativemethodsofthistechnologyentalconditions,affe
2、ctingfactorsandoptimizationofexperimentalresultsefluorescentquantitativePCR;principle;maintypes;quantitativemethod;optimizing 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作
3、物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。 1荧光定量PCR技术的原理 荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规PCR无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个PCR循环反应,定量PCR仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从
4、而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(CycleThreshold,Ct)。Ct值是PCR扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,Ct值取决于阈值。经数学
5、证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与Ct值存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。 2荧光定量PCR技术的主要类型 荧光定量PCR所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBRGreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括TaqMan、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。 2.1SYBRGreenⅠ SYBRGreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。在游离状态下,SYBRGr
6、eenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBRGreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实
7、性。 2.2TaqMan探针 TaqMan探针技术是有美国PerkinElmer(PE)公司研制的一种实时PCR定量技术,在PCR扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在PCR扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,TaqDNA聚合酶的5′→3′外
