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1、实时荧光定量PCR技术的实验研究 摘要实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。 关键词荧光定量PCR技术;原理;主要类型;定量方法;优化 AbstractReal-timefluorescentquantitativePCRisanewkindofnucleicacidquantitativetechnique,whic
2、hdevelopsinthePCRqualitativetechniquebase.Ithasbeenwidelyusedindifferentresearchfields.Inthepaper,theexperimentprinciples,themaintypesandquantitativemethodsofthistechnologyweredescribed.Thecontrolofexperimentalconditions,affectingfactorsandoptimizati
3、onofexperimentalresultswerediscussed. Keywordsreal-timefluorescentquantitativePCR;principle;maintypes;quantitativemethod;optimizing 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1
4、]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。 1荧光定量PCR技术的原理 荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规PCR无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量PCR技术
5、是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个PCR循环反应,定量PCR仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为
6、设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(CycleThreshold,Ct)。Ct值是PCR扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,Ct值取决于阈值。经数学证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与Ct值存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。 2荧光定量PCR技术的主要类型5 荧光定量PCR所
7、使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBRGreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括TaqMan、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。 2.1SYBRGreenⅠ SYBRGreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。在游离状态下,SYBRGreenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数
8、量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBRGreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。 2.2TaqMan探针 TaqMan探针技术是有美国PerkinElmer(PE)公司研制的一
