反复冻融对荧光实时定量pcr质粒标准品的影响研究

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1、反复冻融对荧光实时定量PCR质粒标准品的影响研究作者：王亨莉，陈红涛，孔梅，杨冬铭【摘要】目的评价反复冻融对不同浓度的real-timePCR质粒标准品的影响。方法用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒，紫外分光光度计定量后，根据重组质粒分子量计算其拷贝数，稀释成梯度浓度的荧光实时定量PCR的标准品，取1.0×106拷贝/μl、1.0×104拷贝/μl和1.0×102拷贝/μl高中低3个浓度的标准品，反复冻融1次，6次，11次，16次和21次后，以冻融后的质粒标准品为模板同时进行real-timePCR扩增定量，比较量值变化。结果反复冻融21次以内，高中值稳

2、定，低浓度波动相对较大，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。结论>1.0×104拷贝/μl的高中浓度的质粒标准品可以耐受21次以内反复冻融，低于1.0×104拷贝/μl的质粒标准品反复冻融后量值变化较大，临床使用的试剂盒所配的低浓度标准品应避免反复冻融。【关键词】实时定量PCR;质粒DNA标准品　　【Abstract】ObjectiveToevaluatefreezingandthawingrepeatedlyinfluencingplasmidDNAstandardsforfluoresc

3、ence12quantificationreal-timePCR.MethodsTherecombinantPMT-18plasmidwasclonedintheEscherichiacoliDH5acells.TheconcentrationsofplasmidstocksweredeterminedbytheEppendorfBiophotometer,andthecopynumberofeachplasmidwascalculatedbasedonitsmolecularweight.Plasmidstandardsweremadebypreparingserial10-f

4、olddilutions,theplasmidstandardswerestoredat-20℃.Afterfreezingandthawingplasmidstandards1,6,11,16and21timesrepeatedly,quantityvaluediversityofdifferentconcentrationstandardswasconfirmedbyreal-timePCR.ResultsFreezingandthawinglessthan21times,andtherewasnosignificantchangeobservedinhighandmidco

5、ncentrationsofplasmidstandards,butlowconcentrationsofplasmidstandardswasvaried.Thelargestvariationofhighconcentrationplasmidswas0.06lg,thelargestvariationofmidconcentrationplasmidswas0.18lg,andthelargestvariationoflowconcentrationplasmidswas0.34lg.ConclusionPlasmidstandardsmorethan1.0×104copi

6、es/μlisstablewithinfreezingandthawing21times,plasmidstandardslessthan1.0×104copies/μlisaffectedafterfreezingandthawingrepeatedly,thelowconcentrationstandardinclinicaldiagnosiskitshouldavoidfreezingandthawingrepeatedly.12　　【Keywords】real-timequantitativePCR;plasmidDNAstandard　　基于TaqMan探针技术的实时荧

7、光定量PCR快速高效，灵敏度和特异性高，无需PCR后处理，是目前疾控系统和临床检验定量检测核酸应用最为广泛的一种方法[1～3]。实时荧光定量PCR的质量保证最为重要的一个因素就是标准品，定量结果的准确性在很大程度上依赖于标准品的准确性。目前实时荧光PCR定量标准品大多为重组质粒[4～7]，重组质粒为裸露的螺旋缠绕的双链闭环DNA，质粒在低温条件下可长期稳定保存，与目的基因保持较高的同源性，两者一致的扩增效率是得到较为可靠的定量结果的保证。裸露的双链DNA化学稳定，但物理结构易碎，