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《实时荧光定量PCR标准品的制备及应用.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、414重庆医学2005年3月第34卷第3期·临床研究·实时荧光定量PCR标准品的制备及应用罗勇军,刘昕(第三军医大学分子遗传教研室,重庆400038)摘要:目的探讨并建立快速而准确用于实时荧光定量PCR标准品的方法。方法通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳,胶回收,T2A克隆,测序后,大量提取质粒,送公司定量。结果获得了预期希望的质粒。结论该方法能大量制备质粒标准品,在实验中取得较满意的效果。关键词:实时荧光定量PCR;标准品;Taqman探针中图分类号:R446.61文献标识码:A文章编号:167128348(2005)0320414202Themethodofpre
2、parationforthestandardplasmidsofreal2timePCRanditsapplicationintheexperimentsLUOYong2jun,LIUXin(DeparmentofMolegenetics,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)Abstract:ObjectiveToexplorethemethodofpreparationforthestandardplasmidsofreal2timePCR.MethodsCellculture,RT2PCR,agarosegelel
3、ectrophoresis,gelextraction,T2Aclone,sequance,plasmidsminiprep,quantifyintheBioasiacompany.Re2sultsWegetthestandardplasmids.ConclusionThisisagoodwaytogetthestandardplasmids.Keywords:real2timePCR;standardplasmids;Taqmanprobe近几年来,实时荧光定量PCR技术因高精确度、高灵敏pMD182Tvector0.5μl,48.3ng/μlDNA2μl,H2O:2μl,16℃性、污染少等
4、优点已在临床医学及生物医学基础科研中得到广过夜。泛应用。它是在每个循环后都对扩增产物进行检测,其灵敏度1.2.3.2转化取5μl连接液放入200μl感受态细菌中(1.5比传统PCR高出2～3个数量级,且能通过CT值较好的反映ml离心管),冰上放置30min,42℃静止水浴50s,加1ml/LB,目的DNA初始模板量。随着实时荧光定量PCR的逐步大量颠倒20次,将管子放入37℃摇床(250RPM)复苏50min,取应用,我们也需要能更加精确反映目的DNA的标准品。80μl菌液放入一小管,各加40μlX2gel,4μlIPTG,混匀,涂板1材料与方法(直径7cm),37℃培养18h。1.1实验材料
5、与仪器A549细胞(由本室保存),1640培养1.2.3.3酶切鉴定挑取白色菌落进行小量培养,提取质粒,基(Gibico公司),小牛血清(兰州民海生物),Tripure(Roch公用NEB的EcRo1与HindIII进行酶切,体系为:buffer22μl,司),逆转录试剂(Promega公司),PCR试剂(宝生物公司),EcoRI1μl,HindⅢ1μl,质粒2μl,H2O4μl,37℃酶切3h,酶切胶回收试剂盒(Omega公司),大量质粒抽提试剂盒(Omega公后经1.5%琼脂糖电泳鉴定见图3,并将鉴定为初步正确的质司),pMD182Tvector连接试剂盒(宝生物公司),感受态菌粒的菌落划
6、氨苄平板,挑取单菌落增菌,将菌液送上海基康公JM109(本室保存),氨苄青霉素50mg/ml,LB培养基,按《分子司测序。克隆》配,TAQMAN探针由上海基康公司合成,X2gel,IPTG1.2.4质粒定量证实为ESP1的片段后,大量制备质粒,并(Sigma公司),定量PCR仪为MJrearsh公司的option2,普通保存质粒、菌落。在提取质粒后吸50μl送上海博亚公司定量。PCR仪为MJrearsh公司的PTC2100,nanodrop紫外分光光度实验过程如下,首先测OD260,取10μl质粒稀释到500μl,OD-6),仪。值为0.040,然后算出质粒的质量(OD值×2.5×10再算1.
7、2实验方法出摩尔浓度(质量除以碱基数÷324.5÷10),再乘以阿拂加的23),101.2.1RNA提取用1640培养细胞(饱和湿度,孵箱温度为罗常数(6.02×10结果为3.09×10拷贝/μl。37℃,CO2浓度为5%,10%小牛血清),当细胞融合率到80%1.2.5质粒的倍比稀释将质粒进行倍比稀释,及取10μl质时用Tripure提取总RNA,用紫外分光光度仪检测RNA的量粒加入90μl双蒸
