cd59特异位点的短肽封条对hela细胞凋亡作用的研究

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1、CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡作用的研究：李丽,池沛冬,孟锐,杨滨燕,吴长有【关键词】BrdU增殖流式细胞仪细胞活化　　[Abstract]AIM:ToinvestigatethecorrelationofBrdUincorporationhealthypersonsulatedbyPMAplusIonomycinatdifferentperiodsoftime,BrdUeter.RESULTS:ThepeakofBrdUincorporationulatedfor48hoursinvitro,butnofurtheri

2、ncreaseofthepeakofBrdUincorporatione.Theparisonmadebetulatedfor8hoursulatedfor24hours.Furthermore,nocorrelationbetulatedfor8hoursbutnoobviousincreasee.CulatedulatedbyPMAplusIonomycin.Similarly,thepercentageofBrdU+CD8+TcellsetertoevaluatetheproliferationofTcells.Onlyafeu

3、lationandBrdUincorporationisdependentonstuimulantsandtimeofstimulation.Therefore,BrdUincorporationisnotcorrelatedarkersandcytokineproduction.　　[Keyeter;cellactivation　　通常,人们都是通过3[H]脱氧胸腺嘧啶苷掺入法或MTT比色法来检测T细胞增殖,这些方法测定步骤较多,或敏感性相对较低,且不能从单个细胞水平评价细胞增殖,具有一定限制性。与这些方法不同,脱氧胸腺嘧啶苷的类似

4、物5′溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)可在细胞合成DNA时替代胸腺嘧啶,通过固定和破膜,加入荧光标记的抗BrdU抗体,利用流式细胞术检测BrdU掺入率,从而反映细胞增殖水平[1]。因此,BrdU掺入法在检测细胞增殖时,同时还可以检测表面和胞内分子的表达,从而实现了在单个细胞水平分析细胞增殖。本研究我们系统地比较了不同刺激条件下T细胞的增殖及其与细胞活化分子和细胞因子表达的关系,为基础和临床研究提供科学依据。　　1材料和方法　　1.1材料APC标记的抗CD4抗体(APCCD4)、APCCD8、PECD

5、3、APCIFNγ、APCIL2以及相匹配的对照抗体,鼠抗人CD28单克隆抗体（mAb）、鼠抗人CD3mAb（antiCD3）均购自BD/Pharmingen公司(BectonDickinson/PharMingenUSA);PMA、Ionomycin、BrefeldinA（BFA）及PI均为Sigma公司产品,FITCBrdUFloin）,获取外周血单个核细胞,充分洗涤后,用RPMI1640培养液调整PBMC密度为1×109/L。　　1.2.2淋巴细胞体外刺激培养及BrdU掺入将PBMC1×109细胞/L培养于48孔培养板

6、中,1mL/孔,加入antiCD28(OKT3)（0.2mg/L）+antiCD28（1mg/L）或PMA（20μg/L）+Ionomycin（1mg/L）。培养板置于50mL/LCO2、37℃培养箱培养,分别刺激8、24、48和72h,培养结束前6h分别加入10mg/LBrefeldinA（BFA）,并于培养结束前1h加入10mL/LBrdU（终浓度为10μmol/L）,继续孵育至培养结束,收集细胞。　　1.2.3细胞染色收集细胞后,首先用染色缓冲液（Stainingbuffer）洗涤细胞2次,100μL染色缓冲液重悬细胞,之后加

7、入表面染色抗体,置4℃避光染色25min,染色缓冲液洗涤1次,吸弃上清,100μL固定/通透缓冲液（Cytofix/cytoperm）重悬细胞,室温避光反应20min,通透/洗涤液洗涤细胞1次。加入100μL加强通透液（Cytopermplus）4℃避光反应10min,通透/洗涤液洗涤细胞1次,之后再加入100μL固定/通透缓冲液重悬细胞,室温再次固定细胞5min,通透/洗涤液洗涤细胞1次。每管加入100μL稀释后的DNase,置37℃培养箱孵育1h,通透/洗涤液洗涤细胞1次。加入50μL通透/洗涤液稀释后的BrdUFITC抗体以及

8、胞内抗细胞因子抗体,室温避光反应20min,通透/洗涤液再次洗涤细胞1次。200μL染色缓冲液重悬细胞,流式细胞术（BDCalibur,USA）进行检测,并用Floin上机进行检测。　　2结果　　2.1刺激时间与BrdU