gdnfmrna、gfr.α 1 mrna在不同年龄大鼠svz和海马表达的变化及其意义

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1、GDNFmRNA、GFR.α1mRNA在不同年龄大鼠SVZ和海马表达的变化及其意义　　［关键词］脑室管膜下区;海马;胶质细胞源性神经营养因子;胶质细胞源性神经营养因子受体.α1;大鼠　　近年来神经科学研究的一项重要进展是，发现成年哺乳动物脑内某些特定区域在正常状态下存在神经发生现象。其中脑室管膜下区（subventricularzone，SVZ）和海马颗粒下层（subgranularlayerzone，SGZ）已被证实是神经前体细胞产生最为活跃的区域［1，2］。成年脑的神经发生现象局限于特定的脑区，提示相关生发脑区的微环境可能对神经发生起着重要作用。也有的研究证明微环境的变化与脑老化

2、的过程相关。脑的神经发生与脑老化有可能就是微环境变化影响神经前体细胞的结果。神经生长因子是目前研究最多的调节因子，在体内外，EGF、FGF、IGF.1等均可刺激SVZ细胞增殖，甚至可以调节神经前体细胞的定向分化［3，4］。转化生长因子.β（transforminggroilyrecep-torα1-4，GFR.α1-4）和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸RET蛋白（由原癌基因C.RET编码）所组成。当GDNF结合于GFR.α（主要高亲和性地结合于GFR.α1）时，通过招募RET蛋白形成受体复合物激活下游信号转导途径，从而产生生物学效应［6］。另外研究发现，缺乏RET时，GDNF通过激活G

3、FR.α1相关Src蛋白样激酶途径进行信号转导［7］，故GDNF信号转导途径具有依赖和不依赖RET蛋白两种方式，而GFR.α1是两者的关键信号转导分子。　　现在已知中枢神经系统的可塑性和修复能力随年龄的增加而下降，神经发生现象也随年龄增加而降低，但作为具有广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用的GDNF及其受体GFR.α1，在不同年龄大鼠的表达水平是否与神经发生有关?其增龄变化目前还不是很清楚，尤其从分子水平研究GDNF及其受体的增龄性变化尚未见报道。本研究采用RT.PCR方法观察了不同年龄大鼠GDNF及其受体GFR.α1在SVZ、海马的表达变化，探讨其在神经发生及脑老化进

4、程中的生物学意义。　　1材料与方法　　1.1材料　　RNA抽提试剂盒TrizolReagent（Gibco），RT.PCR试剂盒（TaKaRa），Tris碱、溴酚蓝、EB、EDTA、琼脂糖，SDS（上海生工生物工程公司），DEPC（Fluka公司），DNA分子质量标准DNAMarkerDL2000（TaKaRa）。GDNF分子引物序列:上游引物5′.GACTCCAATGTGCCCGAAGA.3′，下游引物5′.CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC.3′，该引物产生394bp的cDNA片段;GFR.α1分子引物序列:上游引物5′.CTGGAAAGATGAACCGATTG.3′，

5、下游引物5′.CTCTGTGAGAGGGTGAGAAG.3′，该引物产生290bp的cDNA片段。上述引物由潘秋辉设计。β.actin分子引物序列:上游引物5′.ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC.3′，下游引物5′.AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG.3′，该引物产生603bp的cDNA片段，上述引物序列由上海生工生物工程公司合成。　　1.2动物分组与取材　　SD大鼠每组4只，分为孕18d（取胚胎）、新生以及1、3、8、12月龄6组（由中山大学第二附属医院实验动物中心提供）。孕18d组大鼠以0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在体视显微镜下取出胚胎，快速

6、分离胚胎大脑组织，显微镜下分离侧脑室周围区域与海马，用0.01mol・L-1PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。其余5组大鼠以0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，按Sa+1.45、bregma+0.45处进行定位，快速断头、剥离侧脑室周围区域（切取双侧侧脑室外侧壁自室腔面向外侧，其厚度约为1.0mm）［9］与海马组织，用0.01mol・L1PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。　　1.3RNA抽提、RT反应及PCR扩增过程　　1.3.1大鼠SVZ、海马组织RNA的抽提分别取50～100mg脑室管膜下区和海马冻存脑组织，采用Trizol一步

7、法获得RNA，RT和PCR反应过程前取少量作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析。　　1.3.2RT反应在无Rnasin的离心管中依次加入总RNA2μl和DEPC处理水7.5μl，99℃变性5min，冰浴5min，然后加入终浓度为5mmol・L-1的MgCl24μl、1×RTbuffer2μl、1mmol・L-1的dNTP2μl、20U的rnasin0.5μl、15U的RT1μl、Oligo（dT15）1μl，42℃水浴45min，99