cxcl12促进人胃癌ags细胞体外侵袭及其机制

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1、CXCL12促进人胃癌AGS细胞体外侵袭及其机制【摘要】目的研究趋化因子CXCL12对人胃癌AGS细胞侵袭性的影响。方法在体外用不同浓度CXCL12处理AGS细胞后，应用Transangastriccarcinomacell(AGScell).MethodsAGScellsigrationassay,RTPCR,zymographyandELISAotility,invasionandMMP9activityandmRNAexpressionofAGScells.ResultsCXCL12couldincreaseinvas

2、ionabilityofAGScellinvitro.TheactivityofMMP9anner.ThemRNAexpressionofMMP9ofpretreatedAGScellsangastriccarcinomacellsinvitro.KEYMP9肿瘤的侵袭是肿瘤转移的重要环节，是肿瘤细胞粘附、酶降解基质、移动、基质内增殖等一系列过程的表现[1]。本研究体外观察了趋化因子CXCL12对肿瘤体外基质金属蛋白酶MMP9活性以及VEGF表达的影响，以探讨CXCL12促进胃癌细胞侵袭转移的作用机制。1材料和方法1．1

3、实验材料CXCL12购自美国Sigma公司；胰蛋白酶和DMEM培养基(高糖)购自Gibco公司(USA)；胎牛血清购自杭州四季青公司(CHINA)；TrizolReagent购自TaKaRa公司(JAPAN)；MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)、dNTP混合物购自Promega公司(USA)；引物序列由上海Invitrogen公司(USA)合成；Transl青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基，37°C、5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。按如下分组进行实验：空白对照组、50

4、ng/mlCXCL12组和100ng/mlCXCL12组，每组设置3个平行孔。1．2．2Trans孔径)内表面，以此膜分隔上、下小室。无血清DMEM调整细胞浓度为1×106/ml，在上室中加入100μl细胞悬液，在下室中加入600μl含不同浓度CXCL12的无血清培养液，然后在37°C的培养箱中孵育48h，取出滤膜，用4%的多聚甲醛固定，棉签擦去滤膜上未贴壁的细胞，甲醛固定5min，HE染色。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组

5、计数3份样本。1．2．3RNA提取和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)RNA提取参照RNATrizol提取试剂盒的操作说明书进行。提取的RNA纯度由A260/A280比值和1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取1μgRNA，以OligodT为引物逆转录成cDNA。反应体系(20μl)：5×MMLVbuffer4μl，dNTP10mmol，RNase20U，MMLV100U，OligodT20pmol，RNA1μg。逆转录反应条件：20°C10min，42°C60min，95°C5min。取2μl的逆转录产物行PCR扩增，以βac

6、tin作为内参照。MMP9引物：上游5′ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC3′，下游5′GAAGGGGAAGACGCACAGCT3′；βactin引物：上游5′CCTGGCACCCAGCACAAT3′,下游5′GCCGATCCACACGGAGTACT3′。PCR反应条件：95°C5min，94°C60s，57°C45s，72°C60s，35个循环；72°C10min。2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统扫描对PCR产物进行半定量分析，分析结果时以βactin的产物为内对照，计算MMP9/βa

7、ctin比值。1．2．4明胶酶谱法分析CXCL12对基质金属蛋白酶（MMP）活性的影响将对数生长期细胞接种6孔培养板，37°C、5%CO2培养24h后，改换含不同浓度CXCL12的无血清培养液培养；继续培养24h后，收集上清液，离心处理后上清液作为测定的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。制备10%分离胶(含0.1%明胶)，5%浓缩胶；样品与缓冲液按2∶1混匀、加样；10mA恒流、4°C电泳至分离胶时换成15mA恒流；至溴酚蓝刚好到胶底处，停止电泳。分离胶用蒸馏水漂洗2次后加酶缓冲液，置37°C摇床摇36h；水洗，染色、脱色，观察透明

8、带，用凝胶成像仪和LABWOR软件读取透明带并进行定量分析。1．2．5酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中VEGF含量收集各组细胞培养上清，置于-20°C保存待测。ELISA按试剂盒说明书进行操作。根据试剂盒提供的标准品制作标准曲线。每孔加入100