肿瘤相关巨噬细胞促进胶质瘤干细胞侵袭及其机制研究

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1、第三军医大学博士学位论文肿瘤相关巨噬细胞促进胶质瘤干细胞侵袭及其机制研究姓名：叶显宗申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：卞修武201205第三军医大学博士学位论文肿瘤相关巨噬细胞促进胶质瘤干细胞侵袭及其机制研究摘要在成人原发性脑肿瘤中，恶性胶质瘤是较为常见的。由于恶性胶质瘤具有侵袭性强的特点，致使神经外科手术无法完全切除，而后续进行的放疗和化疗又难以彻底地消除残存肿瘤细胞，这些细胞最终引起肿瘤的复发，导致患者预后差，死亡率高。近年来，肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)理论的提出，促使研究者重新审视恶性胶质瘤及其生物学特性。

2、我室和同行的研究表明，恶性胶质瘤中存在胶质瘤干细胞(gliomastemcells，GSCs)，这群细胞在胶质瘤中含量甚微，但却有很强的自我更新和多向分化能力，在肿瘤的发生、发展中都起着关键作用。研究这群细胞的生物学特性，对认识恶性胶质瘤侵袭性生长的特点具有重要意义。已有研究证据表明炎症细胞参与肿瘤的发生发展。肿瘤的免疫微环境及其中浸润的各种免疫细胞参与了肿瘤发生演进的诸多方面，如血管生成、免疫抑制、侵袭转移等。在这些浸润免疫细胞中，肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages，TAMs)所占的比例较高，也是最为重要的一个亚群。然而

3、，关于肿瘤免疫微环境及其中浸润的免疫细胞，如TAMs，对CSCs生物学特性的影响尚有待深入研究。为探讨TAMs在GSCs侵袭性生长中的作用及其机制，本研究首先以CDl33作为标志物，从原代胶质母细胞瘤标本和小鼠恶性胶质瘤细胞系GL261移植瘤中分离并鉴定了GSCs．进一步，我们从恶性胶质瘤动物模型中成功分离了浸润的TAMs，并对其表型进行了鉴定；然后，我们分别在恶性胶质瘤临床标本和动物模型中观察了TAMs与GSCs的空间分布特点，并检测了TAMs对GSCs侵袭的影响；最后，我们研究了TGF．131信号通路及其受体，转化生长因子一13II型受体(typeIIT

4、GF一8receptor，TGFBR2)在TAMs促进GSCs侵袭性生长中的作用并探索了其中可能的治疗干预靶点。研究内容及主要结果和结论如下：1．成功分离并鉴定恶性胶质瘤中的GSCs；①人原代恶性胶质瘤标本中CDl33+细胞的比例具有异质性特点。应用流式分析方法检测5例人原代恶性胶质瘤标本发现，其中CDt33+细胞比例分布在o．1％～14．6％之间。②移植瘤中CDl33+细胞的比例显著增高，并呈稳态。与体外培养的小鼠胶质瘤细胞系GL261相比，其移植瘤中CDl33+细胞的比例显著增高(1．830／硅0．5％坩．0．680／'硅0．46％，p<0．01)；而G

5、L261细胞系移植瘤与分选所第三军医大学博士学位论文得CDl33+细胞所接种的移植瘤中，CDl33+细胞的比例差异不明显(1．830／社0．5％Ⅷ．2．050／社0．52％。p>0．05)。③经过流式分选所得的CDl33+细胞的纯度可以达到80％以上，并且在无血清神经干细胞培养基中具有连续成球能力。(互)CDl33+细胞的平板克隆形成能力显著性强于CDl33一细胞。(曼)CDl33+细胞相比CDl33一细胞，高表达干细胞相关转录因子Sox2及神经干细胞标志物nestin，低表达星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化标志物GFAP和MBP。(查)CDl33+细胞具有

6、多向分化能力，能诱导分化成表达GFAP、MBP或者13-tubulinIII的细胞。(Z)CDl33+细胞相比CDl33一细胞具有更强的成瘤能力，仅l×103个CDl33+细胞即可在对应的动物模型中成瘤，然而GL261细胞系移植瘤和两例人原代恶性胶质瘤标本来源的CDl33一细胞分别需要1×104和5x105个才能成瘤。2．发现恶性胶质瘤中浸润的TAMs呈促进肿瘤生长的M2表型：({)TAMs是恶性胶质瘤浸润免疫细胞中的重要群体之一。流式分析显示，恶性胶质瘤细胞系GL261移植瘤中浸润的所有免疫细胞，即CD45+细胞群体，在总细胞所占的比例约9．3％-4：2．

7、7％：而浸润的巨噬细胞，即CDllb+细胞群体，所占总细胞的比例可以达到6．8％士1．1％；此外，在人胶质母细胞瘤临床标本中，亦可以看到有大量CD68+细胞的分布，特别是在肿瘤侵袭的边缘区域。②应用流式分选的方法，从GL261细胞系移植瘤中可分离得到高纯度的CDllb+F4／80+细胞(94．6％)，即1’AMs；并且这群细胞在光镜下呈圆形或者卵圆形的典型巨噬细胞形态；激光共聚焦显微镜观察，可见到CDllb抗原表达于细胞膜表面。③从正常小鼠脾脏中分离得到与TAMs具有相同表型的正常CDllb+F4／80+巨噬细胞(macrophages，MQ)。④在未给予任

8、何处理，或者给予几．4(20ng／m1)、LPS(1